共表達(dá)NEP1-40和PRP-1多順?lè)醋又亟MscAAV的構(gòu)建*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科 (西安 710061)

楊興春 白轉(zhuǎn)麗 王 瑞 柏宏亮▲

共表達(dá)NEP1-40和PRP-1多順?lè)醋又亟MscAAV的構(gòu)建*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科 (西安 710061)

楊興春 白轉(zhuǎn)麗 王 瑞 柏宏亮▲

目的：構(gòu)建共表達(dá)NEP1-40和PRP-1多順?lè)醋又亟M雙鏈腺相關(guān)病毒(scAAV)。方法：PCR擴(kuò)增NEP1-40、PRP-1及FMDV2A的cDNA，建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA。兩端加入Flag肽和6×His肽后合成融合基因cDNA，克隆到PES載體構(gòu)建出重組質(zhì)粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。雙酶切重組質(zhì)粒PBV220-NT4-NAP和 PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，連接得到重組質(zhì)粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。以腺相關(guān)病毒pSS-CMV構(gòu)建雙鏈腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組得到共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。測(cè)定病毒滴度并利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)檢測(cè)其生物活性。結(jié)果：克隆了共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋尤诤匣騝DNA，基因測(cè)序及核苷酸序列同源性比較結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致；構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，酶切鑒定、核酸序列測(cè)定結(jié)果與理論值一致；重組的雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1應(yīng)用于雞胚背根神經(jīng)節(jié)顯示明顯促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，并顯示出促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長(zhǎng)作用。

近年來(lái)脊髓損傷的病理生理研究中取得了可喜的進(jìn)展，人們對(duì)脊髓損傷后的病理變化和再生困難的認(rèn)識(shí)也有了更深的理解，概括說(shuō)是多種因素相互作用的結(jié)果，其中既有抑制神經(jīng)突起的因素，也有促進(jìn)神經(jīng)再生缺乏的原因，是否能將多種影響脊髓功能恢復(fù)的因素結(jié)合在一起進(jìn)行研究？在分析當(dāng)前研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，本研究提出使用口蹄疫病毒的2A裂解點(diǎn)(FMDV 2A)構(gòu)建多順?lè)醋颖磉_(dá)載體，通過(guò)自互補(bǔ)型腺相關(guān)病毒(Self-complementary AAV, scAAV)載體，同時(shí)表達(dá)富含脯氨酸的下丘腦-垂體神經(jīng)保護(hù)肽(proline-rich peptide PRP-1)和中樞神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)抑制蛋白質(zhì)Nogo的受體拮抗劑(NEP1-40)，試圖通過(guò)促進(jìn)脊髓神經(jīng)再生和阻抑神經(jīng)突起再生蛋白受體(NgR)的雙向作用，為脊髓損傷臨床治療尋找可行的方法。

材料與方法

1 質(zhì)粒與試劑 重組質(zhì)粒PBV220-NT4-NAP質(zhì)粒由楊宇博士惠贈(zèng)，限制性?xún)?nèi)切酶NaeⅠ、EcoRⅠ、Bam HI、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶等購(gòu)自華美生物工程公司。人胚腎293細(xì)胞系、大腸桿菌E.Coli DH5α及載體質(zhì)粒PES、pBV220-NT4 質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒pAAV-Ad，腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒pSSHG-CMV均由西安華廣生物工程公司提供。引物合成及測(cè)序由上海生物公司完成。

2 方 法

2.1 共表達(dá)NEP1-40和PRP-1與多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因cDNA克隆及序列分析

2.1.1 神經(jīng)肽PRP-1的cDNA克隆:由GenBank獲得PRP-1的氨基酸序列，在其氨基端加裝SRR前蛋白轉(zhuǎn)變酶識(shí)別序列AGC CGG CGT，創(chuàng)建Nae I的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。然后按照哺乳動(dòng)物適宜密碼子原則合成cDNA，在cDNA的3`-端加TGA終止密碼子適宜的酶切點(diǎn)(圖1)。將合成的cDNA克隆到PES載體，測(cè)序正確后用Nae I和BamHI雙酶切回收PRP-1的cDNA。

圖1 合成的PRP-1 cDNA結(jié)構(gòu)

2.1.2 神經(jīng)肽NEP1-40的cDNA克隆：從GenBank獲得大鼠Nogo-66 cDNA序列，設(shè)計(jì)正反向引物，在正向引物的5`-端加入編碼SRR的AGC CGG CGT酶識(shí)別點(diǎn)，同時(shí)也是前蛋白轉(zhuǎn)變酶識(shí)別點(diǎn)序列，RT-PCR擴(kuò)增得到編碼SRR的NEP1-40 cDNA。然后將其克隆到PES載體，測(cè)序正確后用Nae I和BamHI雙酶切回收NEP1-40的cDNA。

2.1.3 等分子數(shù)共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A的cDNA克?。簭臄?shù)據(jù)庫(kù)獲得了FMDV 2A的氨基酸序列，按照哺乳動(dòng)物適宜密碼子原則合成編碼FMDV2A的cDNA。再重新合成NEP1-40的反向引物，新引物刪除TGA終止子和BamHI酶識(shí)別位點(diǎn)，使用正反引物并以建立的NEP1-40質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到刪除了終止子的NEP1-40的cDNA。再根據(jù)FMDV2A的cDNA和刪除了終止子的NEP1-40的cDNA序列，合成Overlap PCR引物，使用Overlap PCR原理，擴(kuò)增得到NEP1-40-FMDV 2A嵌合cDNA。再將已經(jīng)建立的PRP-1 cDNA用相同的方法嵌合到NEP1-40-FMDV 2A的下游，建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA結(jié)構(gòu)(圖2)。然后將其克隆到PES載體，測(cè)序正確后用Nae I和BamHI 雙酶切回收嵌合肽cDNA。

圖2 NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA結(jié)構(gòu)示意圖

2.1.4 融合基因cDNA克?。涸谇逗想腘EP1-40-FMDV 2A-PRP-1的cDNA結(jié)構(gòu)的兩端分別加入Flag標(biāo)簽肽和6×His肽的cDNA序列后得到融合基因cDNA。將其克隆到PES載體，構(gòu)建出含有融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的重組質(zhì)粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1(圖3)，測(cè)序正確后用NaeI和BamHI雙酶切回收融合基因cDNA,交公司測(cè)序。

圖3 重組質(zhì)粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1圖譜

2.2 融合基因表達(dá)盒的構(gòu)建策略：重組質(zhì)粒PBV220-NT4-NAP經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NaeⅠ與BamHⅠ聯(lián)合消化后，棄掉NAP，用1%瓊脂糖凝膠電泳法回收PBV220-NT4基因片段。同樣方法經(jīng)NaeⅠ與BamHI聯(lián)合消化PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，回收融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1片段。T4DNA連接酶連接兩片段，得到融合基因表達(dá)盒重組質(zhì)粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1(圖4)。

圖4 融合基因表達(dá)盒重組質(zhì)粒 pBV220-NT4 /NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1構(gòu)建圖

2.3 重組質(zhì)粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的酶切鑒定及核酸序列測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4 構(gòu)建單鏈腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1：堿裂解法大量制備已構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，用EcoRⅠ和BamHI酶切腺相關(guān)病毒pSS-CMV和pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.Coli DH5α菌株，提取質(zhì)粒，酶切篩選并鑒定陽(yáng)性克隆，用EcoRⅠ和BamHI酶切鑒定，篩選的單鏈AAV重組子命名為pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。

2.5 構(gòu)建雙鏈腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1：T4連接酶分別連接NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 cDNA 、線(xiàn)性化的scAAV 載體和△ITR-polyA3個(gè)片段，獲得分泌表達(dá)NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的重組質(zhì)粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，提取質(zhì)粒，酶切篩選并鑒定陽(yáng)性克隆，用EcoRⅠ和BamHI雙酶切鑒定。

2.6 重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的包裝及滴度測(cè)定：重組質(zhì)粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1、輔助質(zhì)粒pAAV-Ad、腺病毒全基因組質(zhì)粒pFG140三質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，收獲并純化重組病毒，收獲的毒種感染293細(xì)胞，離心取上清，-20℃保存，濃縮的病毒使用Dig-GFP 探針斑點(diǎn)雜交法測(cè)定滴度。對(duì)重組病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳測(cè)試。

2.7 生物活性測(cè)定：顯微解剖鏡下分離、摘取8d 雞胚背根神經(jīng)節(jié)(SC-DRG)，將其分散接種于涂布了多聚賴(lài)氨酸的平皿內(nèi)，加入培養(yǎng)基，浸沒(méi)神經(jīng)節(jié)。CO2孵箱內(nèi)，37℃封閉培養(yǎng)12 h 后，分別加入回收的融合基因表達(dá)蛋白0.1μl(實(shí)驗(yàn)組)和等量的培養(yǎng)液(對(duì)照組)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，相差倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)情況。

結(jié) 果

1 共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因測(cè)序及核苷酸序列同源性比較：對(duì)合成的共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因序列進(jìn)行測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致。融合基因核苷酸克隆序列與設(shè)計(jì)的基因核苷酸序列一致。

2 共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因表達(dá)盒的鑒定

2.1 共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因表達(dá)盒的酶切鑒定：重組質(zhì)粒 pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1經(jīng)NaeⅠ與BamHⅠ聯(lián)合消化后，1%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生3.852kb和0.48kb兩個(gè)片段，與理論值完全一致(圖5)。

A:未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1;B:經(jīng)NaeⅠ與BamHI雙酶切后的片段;C:DNA 標(biāo)尺(單位bp)

圖5 融合基因表達(dá)盒重組質(zhì)粒

pBV220-NT4/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1電泳圖

2.2 共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因表達(dá)盒的核酸序列測(cè)定：對(duì)電泳回收的重組融合質(zhì)粒pBV220-NT4/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1插入片段進(jìn)行核酸序列測(cè)定，與設(shè)計(jì)的序列完全一致，說(shuō)明插入片段為融合基因。

3 單/雙鏈腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1鑒定：兩個(gè)腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒酶切后均獲得了與預(yù)期相符480bp條帶。

4 重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的鑒定與滴度測(cè)定：對(duì)重組病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳測(cè)定，產(chǎn)生3.852kb和0.48kb兩個(gè)片段，與理論值完全一致(圖6)。Dig-GFP 探針斑點(diǎn)雜交法測(cè)定滴度3.2×1010pfu/ml，表明構(gòu)建的重組雙鏈腺相關(guān)病毒具有高滴度活性和病毒感染效應(yīng)。

5 生物活性鑒定：實(shí)驗(yàn)組中雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織周緣有神經(jīng)突起呈放射狀長(zhǎng)出(圖7A)。對(duì)照組未見(jiàn)神經(jīng)突起長(zhǎng)出(圖7B)。證實(shí)融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1在原核細(xì)胞中得到了正確表達(dá)和翻譯后加工，具有促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)軸突生長(zhǎng)能力。

A:DNA 標(biāo)尺(單位bp);B:經(jīng)NaeⅠ與BamHⅠ雙酶切后的片段;C:未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒pSSCMV-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1

圖6 pSSCMV-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1質(zhì)粒鑒定電泳圖

A :雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織培養(yǎng)法檢查原核表達(dá)的生物學(xué)活性，加入表達(dá)產(chǎn)物24h后，雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織周緣有大量神經(jīng)突起呈放射狀長(zhǎng)處(×20，倒置相差顯微鏡);B:對(duì)照組未見(jiàn)神經(jīng)突起長(zhǎng)出(×20，倒置相差顯微鏡)

圖7 生物活性鑒定圖

討 論

脊髓損傷后功能恢復(fù)的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。眾多研究表明，目前所使用的方法還需要進(jìn)一步的改進(jìn)和加強(qiáng)，才有可能實(shí)現(xiàn)脊髓損傷后的機(jī)能重建。在分析當(dāng)前研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，本研究提出使用豬口蹄疫病毒2A裂解子(FMDV 2A)構(gòu)建多順?lè)醋拥淖曰パa(bǔ)型腺相關(guān)病毒(scAAV)，目的是同時(shí)等分子數(shù)地表達(dá)脊髓神經(jīng)的突出再生促進(jìn)肽(PRP-1)和阻斷內(nèi)源突出再生抑制蛋白的生物活性肽(NEP1-40)，通過(guò)雙作用機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)損傷脊髓的組織和機(jī)能重建。

Nogo是來(lái)自神經(jīng)鞘的突出生長(zhǎng)抑制因子[2]，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突出再生具有的明顯抑制。NEP1-40是Nogo受體(NgR)的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑。脊髓損傷后寡突膠質(zhì)細(xì)胞表面脫落的Nogo作用于NR來(lái)發(fā)揮作用。敲除NR的動(dòng)物和使用抗NR抗體可以解除神經(jīng)突出的生長(zhǎng)抑制，脊髓和外周神經(jīng)損傷后的突出再生可以大大加強(qiáng)[2]。Hanell A等報(bào)告NEP1-40能夠和NR結(jié)合，竟?fàn)幮砸种芅ogo-66的突出再生抑制作用[3]。研究者[4,5]局部使用合成的NEP1-40治療大鼠中段脊髓背側(cè)半切，幾天后見(jiàn)到明顯的突出再生和機(jī)能恢復(fù)。

富含脯氨酸多肽(PRP)是一組富含脯氨酸的具有神經(jīng)保護(hù)功能的短肽類(lèi)細(xì)胞因子[6]。Galoyan每日給坐骨神經(jīng)橫斷和脊髓橫斷的大鼠肌肉注射10μg/100g的PRP-1，3周后有組織學(xué)的恢復(fù)和機(jī)能改善[7]，而且PRP-1能夠治療鈍挫傷引起的脊髓和腦神經(jīng)變性。提示PRP-1在損傷和退行性腦及脊髓損傷的治療中有巨大潛在應(yīng)用價(jià)值。

FMDA 2A裂解因子是口蹄疫病毒( FMDV)的多聚前體蛋白在2A 的羧基端存在的一小段自裂解序列[8]，其多肽序列中含有一個(gè)高度保守的基序，并在2A起始剪切中起到關(guān)鍵作用。FMDV 2A的剪切活力達(dá)100%，且FMDV 2A基因的選擇與上下游順序?qū)ζ浼羟谢钚曰緵](méi)有影響。使用FMDV 2A可以方便的構(gòu)建多順?lè)醋宰颖磉_(dá)載體，能同時(shí)表達(dá)兩種以上的目的蛋白或目的肽。本研究選用FMDV 2A裂解子構(gòu)建多順?lè)醋颖磉_(dá)載體，目的使獲得上下游神經(jīng)保護(hù)肽NEP1-40和PRPs都能得到有效的表達(dá)[9]。這種同時(shí)表達(dá)多種神經(jīng)再生和營(yíng)養(yǎng)因子的雙靶向雙基因治療策略(Dual-Targeting Dual Gene-Virotherapy)，有利于在脊髓損傷的基因治療中產(chǎn)生更好的效果。

自互補(bǔ)型腺相關(guān)病毒(scAAV)是近年來(lái)重組AAV的重要改進(jìn)[10]。scAAV進(jìn)入細(xì)胞后可以直接表達(dá)，不需要由單鏈變?yōu)殡p鏈的過(guò)程，而且表達(dá)水平相對(duì)較高，非常適于在要求目的基因快速表達(dá)且需要較高表達(dá)水平的基因治療方案中[11]。scAAV的缺點(diǎn)是包裝容量的進(jìn)一步減低，通常不能超越2.1kb[12]。本研究目的cDNA片段短小，構(gòu)建的表達(dá)盒能夠滿(mǎn)足scAAV的包裝要求。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合基因cDNA，經(jīng)對(duì)其進(jìn)行基因測(cè)序及核苷酸序列同源性比較，顯示克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。將共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的多順?lè)醋覨MDV 2A融合全基因與NT4的信號(hào)肽連接，構(gòu)建了融合基因表達(dá)盒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，經(jīng)酶切鑒定、核酸序列測(cè)定和編碼區(qū)編碼氨基酸序列推導(dǎo)，結(jié)果顯示與理論值完全一致。通過(guò)腺相關(guān)病毒pSS-CMV先后構(gòu)建單/雙鏈腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，電泳酶切產(chǎn)物顯示與預(yù)期大小一致的片段。通過(guò)共轉(zhuǎn)染技術(shù)、經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組、包裝后得到共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。測(cè)定重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1病毒滴度也顯示具有高滴度活性和病毒感染效應(yīng)。將其應(yīng)用于體外培養(yǎng)的雞胚背根神經(jīng)節(jié)，表達(dá)蛋白組中有大量神經(jīng)突起向組織塊外四周呈放射狀長(zhǎng)出，而單純培養(yǎng)液組未見(jiàn)明顯神經(jīng)突起長(zhǎng)出。表明構(gòu)建的共表達(dá)NEP1-40和PRP-1的重組雙鏈腺相關(guān)病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1在原核細(xì)胞中得到了正確表達(dá)和翻譯后加工，產(chǎn)生并分泌了具有生物學(xué)活性蛋白，這將為今后進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，并為脊髓損傷的基因治療提供了新的思路。

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(收稿：2014-12-15)

Construction of Multicistronic scAAV containing the FMDV 2A cleavage actor and co-expressing NEP1-40 and PRP-1 Burn & Plastic Department of the First Affiliated Hospital of Medical School of

Xi’an Jiaotong University (Xi’an 700061)

Yang Xingchun Bai Zhuanli Wang Rui et al

Objective: To construct the multicistronic scAAV containing the FMDV 2A cleavage factor and co-expressing NEP1-40 and PRP-1. Methods: PCR technology was used to amplify the NEP1-40, PRP-1 and FMDV2A cDNA. The chimeric peptide cDNA containing NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was set up. Then the fusion gene cDNA was synthetized after adding the Flag peptides and 6×His peptides at ends. The recombinant plasmid PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed by cloning the fusion gene into the PES vector. The recombinant plasmid pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was obtained after digesting and connecting the plasmid PBV220-NT4-NAP and PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1. The double-stranded AAV shuttle plasmid ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed basing on the AAV pSS-CMV. Finally the recombinant scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was obtained by homologous recombination in cells. The titer of the recombinant scAAV was measured and its biological activity was detected in the chicken embryo dorsal root ganglion (EDRG). Results: The fusion gene cDNA for co-expressing NEP1-40 and PRP-1 was cloned. The gene sequencing and nucleotide sequence homology comparison show consistent with the design sequence. The recombinant plasmid pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed and the results of enzyme identification and the nucleic acid sequence were consistent with the theoretical value. The growth of neural processes showed obviously after using the recombinant scAAV in chicken EDRG. Conclusion: The recombinant scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 is constructed successfully and displays promoting role in the chicken EDRG.

@Proline-rich peptide PRP-1 @NEP1-40 Foot and mouth disease virus @Multicistronic vector @Self-complementary AAV

*陜西省科技研究發(fā)展(攻關(guān))計(jì)劃項(xiàng)目(2011K12-12)

@富含脯氨酸多肽 @NEP1-40 口蹄疫病毒 @多順?lè)醋虞d體 @自互補(bǔ)型腺相關(guān)病毒

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.002

▲通訊作者