高良姜揮發(fā)油抑菌及抗氧化作用研究

黃賽金,尹愛武,羅紫英,周慧敏

(1.湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,湖南湘潭 411104;2. 湖南科技學(xué)院生命與化學(xué)工程系,湖南永州 425199)

高良姜揮發(fā)油抑菌及抗氧化作用研究

黃賽金1,尹愛武2,羅紫英2,周慧敏2

(1.湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,湖南湘潭 411104;2. 湖南科技學(xué)院生命與化學(xué)工程系,湖南永州 425199)

研究高良姜揮發(fā)油抑菌及抗氧化作用。以水蒸氣蒸餾法提取高良姜揮發(fā)油,以平板法涂布研究了高良姜揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、枯草桿菌及大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC),以濾紙片固相擴(kuò)散法研究了高良姜揮發(fā)油對(duì)供試菌的抑菌活性。以二丁基羥基甲苯(BHT)為對(duì)照,以花生油在實(shí)驗(yàn)期間的過(guò)氧化值與酸值的變化為指標(biāo),研究了高良姜揮發(fā)油的抗氧化作用。結(jié)果表明,高良姜揮發(fā)油有一定的抑菌作用和抗花生油氧化作用。高良姜揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、枯草桿菌及大腸桿菌的MIC分別為12.0、25.0、150、180 mL/L,對(duì)上述四種菌的抑菌圈值徑分別為:(13.02±0.75)、(11.93±0.71)、(11.26±0.54)、(9.83±0.32) mm。在35 d的實(shí)驗(yàn)期內(nèi),添加高良姜揮發(fā)油的花生油過(guò)氧化值(POV)和酸值(AV)極顯著低于空白對(duì)照組(p<0.01)。在0～14 d實(shí)驗(yàn)期內(nèi)添加0.10%、0.20%、0.30%高良姜揮發(fā)油的花生油過(guò)氧化值和酸值極顯著低于BHT組,但從第21 d起添加高良姜揮發(fā)油的花生油各組過(guò)氧化值和酸值極顯著高于BHT組。

高良姜,揮發(fā)油,抑菌,抗氧化

高良姜(AlpiniaofficinarumHance)是一種藥食同源的中藥,其化學(xué)成分主要含有揮發(fā)油、黃酮類、萜類、雙苯庚烷類、甾醇類和苯丙素類,其具有溫胃止嘔、祛風(fēng)散寒、行氣止痛的功效。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外報(bào)道高良姜具有抗消化道潰瘍、解除胃腸痙攣、止嘔,鎮(zhèn)痛抗炎、抗血栓形成及抗氧化等作用[1-2],其醇提物具有抑制鏈球菌活性的作用[3-4],但目前未見高良姜揮發(fā)油的抑菌與抗氧化作用報(bào)道。為更好開發(fā)利用高良姜資源,本文研究了高良姜揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和釀酒酵母菌的抑菌作用及抗花生油的氧化作用,為進(jìn)一步開發(fā)和利用高良姜資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生油 本課題組壓榨;高良姜 老百姓大藥房;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 湖南科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;瓊脂 福建泉州市泉港化工廠提供;二丁基羥基甲苯(BHT) 食品級(jí)。

HH.BI1.420恒溫培養(yǎng)箱 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市英峪予華儀器。

1.2 培養(yǎng)基的制備

LB培養(yǎng)基:(10 g NaCl、15 g瓊脂,5 g酵母浸粉及10 g蛋白胨),YPD培養(yǎng)基:(10 g酵母浸粉、20 g瓊脂,20 g葡萄糖及20 g蛋白胨)。將各培養(yǎng)基的成分加入到1000 mL去離子水中,調(diào)節(jié)pH到7.4,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。

1.3 高良姜揮發(fā)油的提取

取過(guò)80目篩的高良姜粉末100 g,置于1000 mL平底燒瓶中,加入適量的蒸餾水使其潤(rùn)濕,通入水蒸氣蒸餾4 h,收集餾出液,餾出液用適量石油醚(30～60 ℃)萃取3次,萃取液中加入適量無(wú)水硫酸鈉干燥24 h后過(guò)濾,濾液減壓蒸發(fā)揮去石油醚,得高良姜揮發(fā)油。

1.4 菌懸液及含菌平板的制備

參照文獻(xiàn)[5]制備菌懸液。將供試菌接種至新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后,從斜面培養(yǎng)基上挑取各供試菌,將釀酒酵母菌接種在YPD 液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)2 d;將細(xì)菌接種在LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)1 d。將各供試菌的菌懸液,用無(wú)菌蒸餾水分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7及10-8等8個(gè)濃度梯度的溶液。將大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌分別均勻涂布在LB平板上,37 ℃培養(yǎng)1 d;釀酒酵母菌均勻涂布在YPD 平板上,28 ℃培養(yǎng)2 d,每個(gè)濃度重復(fù)3次。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法,確定菌液的稀釋度,使最后實(shí)驗(yàn)用菌含量1011～1012cfu/L,待用。在無(wú)菌培養(yǎng)基中滴加0.1 mL菌懸液,涂布均勻制成含菌平板,待用。

1.5 MIC的測(cè)定

以質(zhì)量濃度為1%的吐溫-80水溶液作為溶劑[6-7]制備濃度分別為3.00、12. 0、25. 0、50. 0、80.0、100、120、150、180 mL/L的揮發(fā)油稀釋液。取各濃度的揮發(fā)油稀釋液10 mL,分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的菌懸液,搖勻,制成揮發(fā)油與菌懸液的混合液。移取0. 2 mL此混合液于平板中,均勻涂布,于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)1 d,釀酒酵母菌在28 ℃下培養(yǎng)2 d)。觀察菌體生長(zhǎng)情況:無(wú)生長(zhǎng)菌體為陰性(-),生長(zhǎng)菌體為陽(yáng)性(+),以無(wú)生長(zhǎng)菌體對(duì)應(yīng)的最低濃度為揮發(fā)油最低抑菌濃度(MIC)。以質(zhì)量濃度為1% 的吐溫-80水溶液為對(duì)照,重復(fù)3次。

1.6 高良姜揮發(fā)油抑菌效果實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5]將無(wú)水乙醚與揮發(fā)油按1∶1體積混合均勻,得混合液,將滅菌的圓狀濾紙片(直徑d=0.5 cm)放入此混合液中浸泡10 min后取出,揮盡乙醚,將濾紙片貼于含菌平板上,每個(gè)平板呈“品”字形貼三片濾紙片,以無(wú)水乙醚作為空白對(duì)照。將含菌平板置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)1 d,釀酒酵母菌在28 ℃下培養(yǎng)2 d),測(cè)量抑菌圈直徑,每組測(cè)定6次取其平均值。

1.7 高良姜揮發(fā)油抗花生油氧化實(shí)驗(yàn)

精確稱取高良姜揮發(fā)油4.0 g,溶于200 mL無(wú)水乙醇中。取7只燒杯,分別加入一定質(zhì)量的花生油,在1～5號(hào)燒杯中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%的揮發(fā)油-乙醇溶液;6號(hào)燒杯中加入BHT的乙醇溶液作為對(duì)照(BHT的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%);7號(hào)燒杯加乙醇作為空白對(duì)照。混合均勻,將花生油置于(45±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 d。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)測(cè)定花生油的過(guò)氧化值(POV)與酸值(AV),以后每7 d測(cè)定花生油的過(guò)氧化值與酸值,每個(gè)樣品平行測(cè)定 6次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值?；ㄉ偷倪^(guò)氧化值參照GB/T 5538-2005(碘量法)測(cè)定;花生油的酸值參照GB/T5530-1998測(cè)定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜揮發(fā)油對(duì)各供試菌的MIC

高良姜揮發(fā)油對(duì)各供試菌的最低抑菌濃度見表1,由表1可知,高良姜揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、枯草桿菌及大腸桿菌的抑菌濃度各不相同,最低抑菌濃度(MIC)分別為12.0、25.0、150、180 mL/L。隨著揮發(fā)油濃度的增加,其抑菌活性也逐漸增強(qiáng)。高良姜揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌、枯草桿菌及大腸桿菌等四種供試菌的抑制能力最強(qiáng)的是金黃色葡萄球菌,抑制能力最弱的是大腸桿菌,其總的抑菌活性順序:金黃色葡萄球菌>釀酒酵母菌>枯草桿菌>大腸桿菌。

2.2 高良姜揮發(fā)油的抑菌效果

以濾紙片法測(cè)定的抑菌圈直徑為指標(biāo),評(píng)定高良姜揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及釀酒酵母菌的抑菌效果[8]:無(wú)抑菌圈者為不敏感、抑菌圈直徑為7～9 mm為低度敏感、抑菌圈直徑10～15 mm中度敏感、抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感。高良姜揮發(fā)油對(duì)四種供試菌的抑菌效果見表2。從表2中可知:50%高良姜揮發(fā)油對(duì)四種供試菌的抑菌能力均為低或中度敏感。其抑菌圈大小依次為:金黃色葡萄球菌>釀酒酵母菌>枯草桿菌>大腸桿菌。由此可見,高良姜揮發(fā)油具有一定的抑菌能力。

表1 高良姜揮發(fā)油對(duì)各供試菌的MICTable 1 Minimal inhibitory concentration of volatile oil from A.officinarum on different strains

注:-表示無(wú)菌生長(zhǎng);+表示菌體生長(zhǎng)少;++表示菌體生長(zhǎng)較多;+++表示菌體生長(zhǎng)多。

表2 高良姜揮發(fā)油的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of volatile oil from A.officinarum

注:“-”表示無(wú)抑菌圈。

表3 不同實(shí)驗(yàn)期花生油過(guò)氧化值Table 3 The peroxide value of peanut oil in different time of experiment

注:#與空白組比較p<0.01;Δ與BHT組比較p<0.01，表4同。

表4 不同實(shí)驗(yàn)期花生油酸值Table 4 The acid value of peanut oil in different time of experiment

2.3 花生油過(guò)氧化值的測(cè)定結(jié)果

在35 d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)高良姜揮發(fā)油的花生油POV見表3。由表3可知,在35 d實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)各個(gè)不同時(shí)間段,添加高良姜揮發(fā)油與BHT花生油的POV極顯著低于空白對(duì)照組(p<0.01),隨高良姜揮發(fā)油添加量的增加,同期內(nèi)花生油的POV逐漸減小,在第7、14 d添加 0.10%、0.20%、0.30%高良姜揮發(fā)油的花生油POV極顯著低于BHT組的POV,但從第21 d起添加高良姜揮發(fā)油的各組花生油POV極顯著高于BHT組的POV。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高良姜揮發(fā)油具有一定的抗氧化能力,其抗氧化能力與其在花生油中的添加量及貯藏時(shí)間有關(guān)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),其抗氧化能力迅速下降,其中可能的原因是花生油的貯藏環(huán)境溫度較高,高良姜揮發(fā)油揮發(fā)損失所導(dǎo)致。

2.4 花生油酸值的測(cè)定結(jié)果

在35 d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)花生油酸值的變化見表4,在實(shí)驗(yàn)期間的各個(gè)時(shí)段,添加高良姜揮發(fā)油及BHT的花生油酸值極顯著低于空白對(duì)照組(p<0.01),隨高良姜揮發(fā)油添加量的逐漸增加,同期內(nèi)花生油酸值亦逐漸減小,在實(shí)驗(yàn)前期(第7、14 d)添加0.10%、0.20%、0.30%高良姜揮發(fā)油的花生油酸值極顯著低于BHT組,高良姜揮發(fā)油添加量越多其抗花生油酸敗的效果越好,但貯藏后期(從第21 d起)含高良姜揮發(fā)油的各組花生油酸值極顯著高于BHT組,其原因亦可能是花生油貯藏的溫度較高,隨時(shí)間的延長(zhǎng),高良姜揮發(fā)油揮發(fā)所致。

3 結(jié)論

研究表明,高良姜揮發(fā)油對(duì)酵母菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)均有較明顯的抑制作用,其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌及釀酒酵母菌的抑菌圈均在9～15 mm之間。由于揮發(fā)油不溶于水,故其在培養(yǎng)基中不易擴(kuò)散,同時(shí)因揮發(fā)油的揮發(fā)性也降低其在濾紙上的濃度,故高良姜揮發(fā)油的實(shí)際抑菌能力可能更強(qiáng)。高良姜揮發(fā)油可抑制花生油在貯藏過(guò)程中的氧化酸敗反應(yīng)。在一定的濃度范圍內(nèi),貯藏前期其抗氧化能力要強(qiáng)于常用的抗氧化劑BHT,但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)其抗氧化作用要弱于BHT,其原因可能是高良姜揮發(fā)油在花生油中揮發(fā)所致。目前從高良姜揮發(fā)油中分離鑒定的化合物有80余種,海口產(chǎn)高良姜揮發(fā)油[9]主要含有α-蒎烯(5.4%)、β-蒎烯(10.0%)、α-松油醇(8.2%)和樟腦萜(12.9%)。研究表明α-蒎烯、β-蒎烯和樟腦萜有顯著的抗氧化活性[10-11],α-蒎烯能抑制大腸桿菌[12],α-松油醇有抗齲齒病和牙周病病原菌的作用[13]。因此,可以預(yù)測(cè)高良姜揮發(fā)油的抗氧化與抑菌作用與其中的α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油醇和樟腦萜成份有關(guān)。由此可見,高良姜揮發(fā)油可作為一種天然的廣譜抑菌劑、抗氧化劑應(yīng)用于食品中,但作為食品的抗氧化劑,其在食品貯藏期間的穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步的研究。

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我國(guó)食品灌裝機(jī)械自主發(fā)展核心技術(shù)

灌裝機(jī)械在食品機(jī)械行業(yè)中發(fā)展較快，不論是休閑食品還是飲料、飲用水，都離不開灌裝設(shè)備。但是就我國(guó)的灌裝機(jī)械制造行業(yè)來(lái)看，對(duì)技術(shù)的重視程度不夠，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)核心技術(shù)的企業(yè)較少。未來(lái)，還需要不斷提高產(chǎn)品研發(fā)能力，做到與時(shí)俱進(jìn)。

我國(guó)灌裝機(jī)械制造行業(yè)主要是通過(guò)技術(shù)引進(jìn)和測(cè)繪、仿制國(guó)外設(shè)備發(fā)展起來(lái)的。幾十年來(lái)，一直重復(fù)著這樣一個(gè)過(guò)程：落后-引進(jìn)-仿制-落后。目前，具備自主研發(fā)能力的企業(yè)寥寥無(wú)幾，而真正掌握具備國(guó)際先進(jìn)水平的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)核心技術(shù)的更是鳳毛麟角。灌裝機(jī)械制造行業(yè)缺乏知識(shí)產(chǎn)權(quán)意識(shí)，不僅對(duì)自主研發(fā)的新技術(shù)、新產(chǎn)品缺乏專利權(quán)保護(hù)意識(shí)，而且肆意仿造抄襲他人產(chǎn)品技術(shù)，讓市場(chǎng)變得混亂，令用戶難辨真?zhèn)?，開發(fā)者遭受巨大損失，在這種情況下，一些堅(jiān)持自主開發(fā)的企業(yè)也步入抄襲的行列，整個(gè)行業(yè)就演變成互相抄襲的混亂局面。

造成這種現(xiàn)象的根本原因不在于是否應(yīng)該引進(jìn)技術(shù)、是否應(yīng)該仿制，而是在于如何正確地看待技術(shù)研發(fā)。我國(guó)灌裝機(jī)械制造行業(yè)有待建立科學(xué)技術(shù)是核心競(jìng)爭(zhēng)力的發(fā)展觀念，不在乎今天能夠賺取多少利潤(rùn)，而應(yīng)該在乎如何能更好地滿足用戶。當(dāng)把滿足用戶需求放在第一位，用戶自然會(huì)慢慢變多，企業(yè)自然會(huì)慢慢變大、變強(qiáng)。我國(guó)灌裝機(jī)械制造行業(yè)應(yīng)緊緊把握市場(chǎng)的需求，積極研發(fā)適應(yīng)市場(chǎng)需求的技術(shù)和產(chǎn)品，打造自己的核心競(jìng)爭(zhēng)力。

來(lái)源：慧聰食品工業(yè)網(wǎng)

Study on the bacteriostasis and antioxidation ofAlpiniaofficinarumHance volatile oil

HUANG Sai-jin1,YIN Ai-wu2,LUO Zi-ying2,ZHOU Hui-min2

(1.Department of Chemistry Engineering,Hunan Institute of Engineering,Xiangtan 411104,China;2.Department of Life Science and Chemistry,Hunan University of Science and Engineering,Yongzhou 425199,China)

To study the antimicrobial activity and the antioxidation of volatile oil fromAlpiniaofficinarum,volatile oil was extracted by water steam distillation. The minimum inhibitory concentration(MIC)and antimicrobial activity toStaphylococcusaureus,Saccharomycescerevisiae,BacillussubtilisandEscherichiacoliwere investigated by plate spread and by plate diffuse. Peroxide value,acid value as indexes and peanut oil as mediums,compared with antioxidants,BHT,the antioxidation of volatile oil fromA.officinarumHance were also studied. The results showed volatile oil fromA.officinarumhad antimicrobial activity and antioxidation to peanut oil. The minimum inhibitory concentration(MIC)of volatile oils fromA.officinarumtoStaphylococcusaureus,Saccharomycescerevisiae,BacillussubtilisandEscherichiacoliwas 12.0,25.0,150 and 180 mL/L and the diameter of bacteriostasis was(13.02±0.75),(11.93±0.71),(11.26±0.54),and(9.83±0.32)mm respectively. In the experiment time of 35 d,the peroxide value and acid value of peanut oil groups added volatile oil were significantly lower than those of blank group. During 0 to 14 d experiment time,the peroxide value and acid value of peanut oil groups added volatile oil(0.10%,0.20% and 0.30%)were significantly lower than those of BHT group but significantly higher during 21～35 d.

AlpiniaofficinarumHance;volatile oil;bacteriostasis;antioxidation

2014-12-30

黃賽金(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail:huangsaijinpp@163.com。

湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助(2011-76)；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助(2012-318)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)19-0112-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.19.014