乳清分離蛋白在難溶性鈣鹽表面吸附特性的研究

文麗杰,劉影帝,劉小鳴,胡錦華,*,周 鵬,,3,*

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;>2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;>3.江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇無(wú)錫 214122)

乳清分離蛋白在難溶性鈣鹽表面吸附特性的研究

文麗杰1,劉影帝1,劉小鳴2,胡錦華1,*,周 鵬1,2,3,*

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;>2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;>3.江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇無(wú)錫 214122)

本文主要研究了乳清分離蛋白(WPI)在三種難溶性鈣鹽表面的吸附特性及吸附WPI后鈣鹽的分散穩(wěn)定性,考察的鈣鹽包括碳酸鈣、羥基磷灰石和磷酸三鈣。測(cè)定了WPI的吸附對(duì)鈣鹽顆粒的表面電荷、激光共聚焦成像、吸附等溫線、吸附競(jìng)爭(zhēng)性以及濁度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,WPI在鈣鹽表面存在吸附,并引起了鈣鹽表面電荷量的增加;WPI與三種鈣鹽發(fā)生了不同類(lèi)型的吸附行為;WPI中的β-乳球蛋白在鈣鹽表面的吸附優(yōu)先于α-乳白蛋白;吸附WPI后的鈣鹽顆粒在溶液濁度測(cè)定時(shí)表現(xiàn)出比原本鈣鹽顆粒分散液更好的穩(wěn)定性。該研究對(duì)改善高鈣牛奶及高鈣飲料的穩(wěn)定性方面具有重要意義。

乳清分離蛋白,碳酸鈣,磷酸鈣,吸附,懸浮穩(wěn)定性

近期有學(xué)者研究了乳蛋白在羥基磷灰石上的吸附[11],以此為基礎(chǔ),本研究旨在以食品中常用的蛋白配料——乳清分離蛋白(WPI)為研究對(duì)象,探索其在不同鈣鹽表面的吸附過(guò)程以及蛋白和鈣鹽之間的相互作用機(jī)理,為改善高鈣食品及高鈣飲料的穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI 90) 美國(guó)Hilmar公司;碳酸鈣(CaCO3) 日本Maruo公司,由比表面積檢測(cè)法(BET法)測(cè)得CaCO3平均粒徑1.30 μm,比表面積為13.8 m2/g;羥基磷灰石(HA,Ca5(PO4)3OH)和磷酸三鈣(TCP,Ca3(PO4)2) 德國(guó)Budenheim化學(xué)公司,測(cè)得HA和TCP的平均粒徑d(50)分別為2.06,1.93 μm,BET法測(cè)得比表面積分別為88.6、67.2 m2/g;異硫氰酸熒光素(FITC) 美國(guó)Sigma公司;其它試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

S3500激光粒度分析儀 美國(guó)麥奇克公司;Nano-ZS激光粒度儀 英國(guó)馬爾文公司;TCS SP8激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)萊卡公司;Gel Doc EZ凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;SevenEasy pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司;UV-1200可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 WPI在鈣鹽表面的吸附 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用兩種不同的吸附方式。吸附方式1:精密稱(chēng)取20 mg難溶性鈣鹽置于0.5 mL超純水,形成鈣鹽分散液,再加入0.5 mL WPI溶液(0.04～40 mg/mL),最終蛋白和鈣鹽懸浮液中的WPI濃度在0.02～20 mg/mL。懸浮液在室溫下用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器培養(yǎng)2.5 h,確保鈣鹽對(duì)蛋白的吸附達(dá)到平衡[12-13],離心(7000 r/min,7 min)后分離沉淀和上清液,分別作進(jìn)一步的檢測(cè)。吸附方式2:為測(cè)定WPI中不同蛋白組分在鈣鹽表面吸附過(guò)程的差異性,分別稱(chēng)取2～450 mg鈣鹽于0.5 mL超純水中,制備成鈣鹽分散液,再加入WPI溶液(0.5 mL,4 mg/mL)制成二者的共混懸浮液,在室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2.5 h后進(jìn)行離心,將取得的上清液用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析,考察WPI中不同蛋白組分在吸附過(guò)程中的差異性。

1.2.2 鈣鹽吸附WPI前后顆粒表面電荷的變化 將懸浮液離心后所得的沉淀重新分散在超純水中(0.05% w/w),用馬爾文ZetasizerNano-ZS對(duì)再分散液進(jìn)行表面電位的檢測(cè),保持溫度20 ℃。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3 WPI吸附在鈣鹽表面的圖像表征 采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察WPI在鈣鹽表面的吸附。將懸浮液離心后所得的沉淀重新分散在超純水中得到濃度為0.05%(w/w)的再分散液,對(duì)照組為不添加WPI的鈣鹽分散液。用FITC進(jìn)行染色后,在40×鏡頭和488 nm Ar/Kr的激光器下,通過(guò)FITC熒光通道觀察圖像。

1.2.4 鈣鹽吸附WPI后顆粒表面蛋白濃度的測(cè)定 為檢測(cè)吸附在鈣鹽顆粒表面的蛋白量,采用Lowry法[14]分析吸附了WPI(WPI初始濃度小于1 mg/mL)后的CaCO3在水相中的再分散液經(jīng)過(guò)離心后得到的上清液;采用Biuret法[15]分析HA和TCP吸附了WPI后的再分散液經(jīng)離心分離后得到的上清液。上清液中蛋白量與初始蛋白濃度的差值就是被吸附到鈣鹽上的蛋白量,表面蛋白濃度則通過(guò)被吸附的蛋白量與鈣鹽顆粒的總表面積進(jìn)行計(jì)算。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.5 WPI中不同蛋白組分在鈣鹽顆粒表面吸附過(guò)程的差異性考察 準(zhǔn)確吸取0.5 mL按照吸附方式2制得的鈣鹽再分散液經(jīng)過(guò)離心后得到的上清液,與0.5 mL樣品緩沖液(0.5 mol/L Tris,4.0% w/v SDS和0.01% w/v溴酚藍(lán))混合,用沸水浴煮沸3 min后冷卻,然后準(zhǔn)確取樣20 μL,上樣于SDS膠板(12%的分離膠和4%的濃縮膠),用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液對(duì)蛋白染色,再用7.5%乙酸和5%甲醇溶液脫色。通過(guò)凝膠成像儀定量分析蛋白條帶亮度的變化,用上清液中的蛋白余量與初始蛋白總量的比值變化來(lái)分析上清液中的殘余蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下的差異性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 鈣鹽吸附WPI后的再分散液的溶液穩(wěn)定性表征 將表面吸附了WPI之后的鈣鹽重新分散到超純水中,得到0.125%(w/w)再分散液,用可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行濁度的表征,記錄900 nm[11]波長(zhǎng)下120 min內(nèi)的再分散液吸光度值的變化。通過(guò)(1)式得到溶液吸光度值隨時(shí)間的減少量:

吸光度值變化(%)=(At/A0)×100

式(1)

式中，At為t時(shí)間再分散液的吸光度值,A0為起始吸光度值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS8.0軟件,方差分析使用一般線性模型,當(dāng)p<0.05時(shí),認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面電位的表征

分別測(cè)定WPI和難溶性鈣鹽在超純水中的pH,測(cè)得WPI水溶液的pH為7.0,HA和TCP分散液的pH均在7.0～7.5范圍內(nèi),而CaCO3的水相分散液pH約為9.3。考慮到引入其他離子可能會(huì)對(duì)WPI在鈣鹽顆粒表面吸附過(guò)程和特性造成影響,因此本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)僅在純水相介質(zhì)中研究WPI在鈣鹽顆粒表面的吸附和它們之間的相互作用。

ζ-電位表征了分散在水中的顆粒其表面所帶電荷的狀態(tài)。圖1是CaCO3、HA和TCP顆粒表面吸附了不同濃度的WPI后ζ-電位的變化情況。如圖1所示,加入了WPI之后,鈣鹽顆粒表面的ζ-電位絕對(duì)值增大,隨著WPI濃度的增加,表面電位會(huì)達(dá)到最大值。例如,超純水中不添加蛋白的TCP,其顆粒表面ζ-電位值為-2.7 mV,隨著添加的WPI蛋白濃度逐漸增大到2 mg/mL,TCP的ζ-電位變化到-13.2 mV,但是繼續(xù)增大蛋白的濃度,ζ-絕對(duì)值則不再變化。WPI的等電點(diǎn)約為pH4.2～pH5.3,當(dāng)溶液的pH高于其等電點(diǎn)時(shí),WPI蛋白組分本身帶負(fù)電荷,因此當(dāng)加入了WPI后TCP表面ζ-電位的變化表明WPI被吸附到了鈣鹽顆粒表面,從而使鈣鹽顆粒表面帶上了更多負(fù)電荷。當(dāng)?shù)鞍自阝}鹽顆粒表面的吸附達(dá)到飽和狀態(tài)后,ζ-電位不再變化。

圖1 CaCO3、HA和TCP顆粒表面ζ-電位隨吸附WPI濃度的變化Fig.1 The ζ-potential change of CaCO3,HA and TCP upon different WPI concentration

2.2 激光共聚焦表征

激光共聚焦(CLSM)圖像(圖2)進(jìn)一步證實(shí)了WPI在不同種類(lèi)的鈣鹽顆粒表面的吸附。FITC是針對(duì)蛋白染色的熒光染料,在只含有鈣鹽的對(duì)照組(未給出)的成像中證實(shí)FITC不能對(duì)鈣鹽染色。將鈣鹽與WPI旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2.5 h后離心,將所得到的沉淀進(jìn)行再分散,用FITC染色后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡的FITC通道進(jìn)行觀察。如圖2所示,不同鈣鹽的顆粒表面都吸附上了WPI,在FITC圖像中可以觀察到在沒(méi)有被染色的鈣鹽顆粒(黑色的、近似球狀的中心)的外部包裹了一圈灰色圓環(huán),也就是被FITC染色的WPI吸附到了鈣鹽顆粒表面。

圖2 吸附WPI后CaCO3,HA和TCP顆粒激光共聚焦圖像Fig. 2 CLSM images of CaCO3,HA and TCP coated with WPI

對(duì)于HA和TCP而言,二者都屬于磷酸鈣鹽,它們的基本元素組成相同,HA和TCP上都存在2種不同類(lèi)型的吸附位點(diǎn),即C-位點(diǎn)(鈣離子)和P-位點(diǎn)(磷酸根離子)[18-19]。與CaCO3類(lèi)似,C-位點(diǎn)與WPI的羧基、P-位點(diǎn)與WPI的氨基都能通過(guò)靜電相互作用進(jìn)行結(jié)合,且C-位點(diǎn)與羧基的親和力大于P-位點(diǎn)與氨基的親和力。因此C-位點(diǎn)與WPI的羧基間的作用是WPI在HA和TCP上吸附的主要驅(qū)動(dòng)力。

2.3 吸附等溫線的表征

圖3用吸附等溫線表達(dá)了WPI在三種不同鈣鹽顆粒上吸附行為。吸附等溫線描述的是吸附過(guò)程,通常分為4種類(lèi)型,即C、L、H和 S型等溫線[20]。C型等溫線是一條過(guò)原點(diǎn)的直線,表明吸附質(zhì)在液相和吸附劑表面相的分配比是恒定的。L型等溫線是最常見(jiàn)的吸附模式,表現(xiàn)為吸附質(zhì)在吸附劑表面逐漸增多,直到達(dá)到吸附飽和,并且在達(dá)到吸附飽和前,曲線的斜率幾乎不變。H型等溫線是一種特殊的L型等溫線,表現(xiàn)為在很低的濃度下,吸附質(zhì)就能被顯著地吸附,使得曲線的初始斜率接近無(wú)窮。S型等溫線的起始部分斜率小,當(dāng)液相吸附質(zhì)的平衡濃度達(dá)到一定值,吸附等溫線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)突躍,其后曲線的增長(zhǎng)又趨于平緩。從圖3中可以看出,WPI在CaCO3表面的吸附等溫線可以歸類(lèi)于S型。這可以解釋為:溶劑(水)在吸附劑(CaCO3)表面有強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)吸附,所以在低濃度時(shí),吸附質(zhì)(WPI)在鈣鹽表面沒(méi)有明顯的被吸附優(yōu)勢(shì),而當(dāng)吸附質(zhì)的平衡濃度增加到一定值時(shí),已被吸附的WPI分子對(duì)溶液中的WPI有明顯的吸引作用。WPI在HA表面的吸附等溫線則是明顯的L型,平衡時(shí)溶液中WPI濃度的增加,被HA表面吸附的WPI逐漸增加,直到達(dá)到吸附飽和狀態(tài)。WPI在TCP表面的吸附等溫線表現(xiàn)為H型,在低濃度下,WPI就顯著被吸附在TCP上,說(shuō)明TCP對(duì)WPI擁有很高的親和性。同屬于磷酸鈣類(lèi)的HA和TCP在吸附WPI的過(guò)程中表現(xiàn)出了明顯不同的吸附類(lèi)型和吸附量(表面蛋白濃度),這可能主要是由兩種磷酸鈣晶體結(jié)構(gòu)的差異性引起的。一方面,HA中的Ca與磷酸基團(tuán)的距離一般小于TCP晶胞中的Ca與磷酸基團(tuán)的距離,從晶體結(jié)構(gòu)上判斷HA中Ca和磷酸基團(tuán)的反應(yīng)活性小于TCP中的;另一方面,TCP晶胞中單位面積的Ca和磷酸基團(tuán)的數(shù)目明顯地多于HA[21]。因此,在HA和TCP比表面積相差不大的情況下(HA和TCP的比表面積分別為88.6、67.2 m2/g),TCP對(duì)WPI的親和力和吸附量顯著高于HA。

圖3 CaCO3、HA和TCP對(duì)WPI的吸附等溫線Fig.3 The adsorption isotherms of WPI onto CaCO3,HA and TCP

2.4 表面蛋白組成和優(yōu)先吸附

圖4是在鈣鹽顆粒吸附了WPI后,用SDS-PAGE定量分析了WPI中不同蛋白組分在上清液中的殘余量的變化情況。與對(duì)照組(純WPI溶液)相比,蛋白條帶的整體強(qiáng)度是隨著鈣鹽添加量的增加而逐漸減小的,說(shuō)明被鈣鹽顆粒吸附之后,留在上清液中的蛋白濃度逐漸減小。將WPI中的不同蛋白組分β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)的條帶進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)WPI在三種不同的鈣鹽顆粒表面的吸附過(guò)程類(lèi)似,β-Lg的條帶強(qiáng)度減弱的程度要比α-La的條帶更為快速,說(shuō)明β-Lg比α-La在鈣鹽顆粒表面的吸附更具優(yōu)勢(shì)。如圖4A1和圖4A2所示,當(dāng)CaCO3濃度達(dá)到450 mg/mL時(shí),上清液中幾乎沒(méi)有β-Lg存在,而仍有約1/3的α-La殘留。也就是說(shuō)WPI中β-Lg和α-La在這三種鈣鹽表面相互作用時(shí),β-Lg會(huì)被優(yōu)先吸附。

WPI的不同組分在鈣鹽表面吸附過(guò)程的差異性或許與蛋白的電荷分布有關(guān)。有研究表明蛋白表面的電荷分布對(duì)HA與蛋白間的親和力非常重要[9]。β-Lg所帶正電荷均勻分布在其表面,而α-La的正電荷主要集中在一個(gè)區(qū)域[22-23],因此,電荷分布的差異使得β-Lg能在鈣鹽顆粒表面被優(yōu)先吸附。另一方面,β-Lg的等電點(diǎn)為pH5.2,α-La的等電點(diǎn)則在pH4.3左右[24]。在本實(shí)驗(yàn)條件下(pH7),α-La比β-Lg所帶凈負(fù)電荷更多,與同樣帶負(fù)電荷的鈣鹽間靜電排斥力更大,從而一定程度上阻礙了鈣鹽表面對(duì)α-La的吸附。此外,從動(dòng)力學(xué)角度來(lái)看,到達(dá)界面的速率也會(huì)決定混合物中組分吸附行為的差異性[25]。β-Lg是WPI中的主要蛋白組分,其含量大于α-La,在與鈣鹽顆粒表面相互作用時(shí),量多的β-Lg比α-La更有優(yōu)勢(shì)。

2.5 懸浮液穩(wěn)定性的表征

通過(guò)分光光度法來(lái)表征一定時(shí)間內(nèi)的懸浮液的穩(wěn)定性。圖5是吸附了WPI后的鈣鹽再分散液的溶液吸光度隨時(shí)間的變化情況。不同的鈣鹽顆粒吸附WPI后,其再分散液都表現(xiàn)出了相似的穩(wěn)定性變化。沒(méi)有吸附WPI的對(duì)照組沉降速率很快,而WPI的吸附使得鈣鹽再分散液的穩(wěn)定性有了明顯的改善。以吸附了WPI的CaCO3為例(圖5A),增加WPI的濃度,可以看到再分散液的溶液吸光度值減小的速率顯著下降,也就是說(shuō)吸附了更多WPI的CaCO3顆粒沉降速率下降,鈣鹽再分散液的穩(wěn)定性得到明顯改善。同樣的現(xiàn)象在吸附了WPI的HA和TCP中也能被觀察到。

圖6所示為吸附了WPI的鈣鹽再分散液(10% w/w)在室溫下靜置10 h后的照片。與圖5的結(jié)果一致,加入WPI的蛋白濃度越高,鈣鹽再分散液的穩(wěn)定性改善效果越好,達(dá)到吸附飽和后,蛋白濃度對(duì)鈣鹽再分散液的溶液穩(wěn)定性則沒(méi)有更進(jìn)一步的提升。

圖4 WPI組分在三種鈣鹽上的吸附優(yōu)先性Fig.4 The adsorption difference of β-Lg and α-La onto various calcium particles注:A1～C1為上清液殘留WPI蛋白組分的SDS-PAGE凝膠電泳;A2～C2為電泳圖對(duì)應(yīng)的定量分析;A:CaCO3;B:HA;C:TCP;電泳圖上的數(shù)字表示難溶性鈣鹽的濃度(mg/mL)。

圖5 吸附了WPI的CaCO3、HA和TCP的再分散液(0.125% w/w)的溶液穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化Fig.5 Suspension stability of CaCO3,HA and TCP particles(0.125% w/w)coated with WPI

圖6 靜置10 h后WPI吸附量對(duì)鈣鹽分散液的懸浮穩(wěn)定性影響Fig.6 Apparent stability of CaCO3、HA and TCP particles coated with WPI after 10 h注:制備吸附WPI的CaCO3中WPI濃度:O～D分別為0、0.02、0.05、0.075、0.2 mg/mL WPI;制備吸附WPI的HA中WPI濃度:O～D分別為0、0.5、1、2、4 mg/mL WPI;制備吸附WPI的TCP中WPI濃度:O～D分別為0、0.5、2、4、6 mg/mL WPI,離心得到吸附WPI后的鈣鹽重新分散在水中得到懸浮液(2% w/w)靜置10 h后拍照。

3 結(jié)論

本文研究了WPI在三種難溶性鈣鹽(CaCO3、HA及TCP)的顆粒表面的吸附過(guò)程。WPI與鈣鹽之間主要是通過(guò)鈣鹽顆粒表面的Ca2+位點(diǎn)和WPI的羧基之間較為強(qiáng)烈的相互作用以及鈣鹽顆粒表面的碳酸根或磷酸根與WPI的氨基間相對(duì)弱勢(shì)的相互作用進(jìn)行吸附。與α-La相比,β-Lg在三種鈣鹽表面的吸附更具優(yōu)勢(shì)。吸附了WPI之后的鈣鹽比鈣鹽自身帶有更多的負(fù)電荷,其再分散液都顯示出更好的溶液穩(wěn)定性。這將為研發(fā)貨架期內(nèi)產(chǎn)品性質(zhì)更加穩(wěn)定的高鈣食品及高鈣飲料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on the adsorption of whey protein isolate on the insoluble calcium particles

WEN Li-jie1,LIU Ying-di1,LIU Xiao-ming2,HU Jin-hua1,*,ZHOU Peng1,2,3,*

(1.State Key Laboratory of Food Science & Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science & Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition,Wuxi 214122,China)

The investigation on the adsorption of whey protein isolate(WPI)onto different calcium particles,including calcium carbonate,hydroxyapatite and tricalcium phosphate,were carried out via different characterizations including ζ-potential,confocal laser scanning microscope,adsorption isotherms,preference adsorption and suspension stability. The surface charge of calcium particles were increased after WPI was adsorbed. Different adsorption behaviors were concluded for different calcium particles according to the calculated adsorption isotherms. β-Lactoglobulin was observed to be preferentially adsorbed on to the particle surface compared with α-lactalbumin. The stability of the insoluble calcium salt suspension were improved with WPI adsorbed,which was a great significance for the improvement of calcium fortified milk or beverage.

whey protein isolate;calcium carbonate;calcium phosphate;adsorption;suspension stability

2015-01-13

文麗杰(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：wenlijie@163.com。

*通訊作者:胡錦華(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：hujinhua@jiangnan.edu.cn。 周鵬(1975-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zhoupeng@fingnan.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31471697)；復(fù)旦大學(xué)聚合物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(K2015-20)；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)課題(SKLF-ZZB--01401)；教育部科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(113032A)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-11-0666)；江南大學(xué)自主科研計(jì)劃(JUSRP11440)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)19-0062-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.19.004