美味牛肝菌(Boletusedulis)對鎘(Ⅱ)的生物富集特性研究

李金城,鮑長俊,孫 云,莊永亮,孫麗平

(昆明理工大學云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

美味牛肝菌(Boletusedulis)對鎘(Ⅱ)的生物富集特性研究

李金城,鮑長俊,孫 云,莊永亮*,孫麗平

(昆明理工大學云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

本文研究了美味牛肝菌液體發(fā)酵對不同濃度鎘(Ⅱ)(Cd2+,0、16、32、48、64、80 mg/L)的生物富集特性。結果表明,Cd2+處理顯著抑制了美味牛肝菌菌絲體的生長(p<0.05),生長抑制率為50%的Cd2+濃度為56 mg/L。菌絲體對Cd2+的生物富集量可高達3335.7 mg/kg DW,富集系數為52.1(p<0.05)。菌絲體中可溶性總糖和多糖含量隨Cd2+濃度的升高呈現先上升后下降的趨勢,Cd2+處理菌絲體中的多糖含量均高于無Cd2+組(p<0.05);菌絲體中可溶性蛋白含量隨Cd2+濃度的升高先降低后上升,80 mg/L Cd2+處理組顯著高于無Cd2+組(p<0.05)。Cd2+處理對菌體過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈現顯著的“低促高抑”的影響趨勢(p<0.05),而過氧化物酶(POD)活性被顯著抑制(p<0.05)。表明美味牛肝菌對Cd2+具有很強的生物富集能力,可能是菌體的特定成分如多糖、蛋白等協(xié)同抗氧化酶系增強了菌體對Cd2+的耐受性和富集性能。

美味牛肝菌,鎘,生物富集,食品安全性

美味牛肝菌(Boletusedulis),俗稱白牛肝、大腳菇,屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、牛肝菌科,是一種世界范圍內分布的食藥兼用的真菌。美味牛肝菌在云南的產量很高,具有很高的經濟價值。據報道,美味牛肝菌營養(yǎng)價值很高[1],富含多糖等功能性物質[2],能增強機體免疫力,具抗腫瘤、抗突變、降血脂、抗病毒等功效。然而,近年來環(huán)境重金屬污染日益嚴重,美味牛肝菌對鎘具有很強的生物富集能力和耐受性[3]。本項目組對云南省野生食用菌重金屬含量的初步調研,也發(fā)現了很多鎘含量超過國家限量標準的美味牛肝菌樣本,個別菌株鎘含量達到7.35 mg/kg DW,雖然遠遠低于Collin-Hansen等[4]報道的由挪威鋅礦區(qū)采集的美味牛肝菌中的126 mg·kg-1DM,但是具有潛在的食品安全隱患。

美味牛肝菌對鎘的富集,一方面影響了其食品安全性,需要對其進行有效的質量和安全控制;另一方面,提示可探索對重金屬具有高富集能力和耐受性的蕈菌,在環(huán)境的生物治污方面具有重要意義。因此,需要研究美味牛肝菌對鎘的生物富集特性,為上述兩點的研究提供理論基礎。研究表明,重金屬脅迫下,植物和真菌的首要防御系統(tǒng)是胞壁多糖、一些金屬結合蛋白、及其抗氧化酶系等[5]。美味牛肝菌對鎘的生物富集機制可能也與菌體內的特定成分及其抗氧化酶系有關。目前尚未見此類的研究報道。本項目在實驗室可控培養(yǎng)條件下,針對鎘(Ⅱ)(Cd2+)對美味牛肝菌菌絲體液體發(fā)酵性能及其主要成分含量的影響,以及菌絲體對Cd2+的生物富集性能進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌(Boletusedulis) 購于中科院微生物菌種保藏中心,PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂2%,pH自然)活化。實驗用水為超純水;鎘元素標準溶液(1000 μg/mL) 購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心;過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、過氧化物酶(POD)測定試劑盒(紫外法) 購于南京建成生物工程研究所;瓊脂和葡萄糖,生物培養(yǎng)用試劑 購于sigma;其它為分析純試劑。

YXQ-LS-30SH型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 江蘇凈化設備有限公司;QYC-2012C震蕩培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;TU-1901雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;AAS400G型原子吸收光譜儀 德國耶拿;3k15型冷凍離心機 德國sigma。

1.2 實驗方法

1.2.1 美味牛肝菌實驗室的可控培養(yǎng) 制備PDA液體培養(yǎng)基,滅菌,接活化菌種,27 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d,得種子液。

根據本研究預實驗得到的菌絲生長半數抑制率的Cd2+濃度,設置培養(yǎng)基中Cd2+濃度為0、16、32、48、64、80 mg/L。將制備好的種子液打碎,按3%接種量接種于Cd2+濃度為0、16、32、48、64、80 mg/L的250 mL的三角瓶中(每個三角瓶裝液量100 mL PDA液體培養(yǎng)基),重復6次,27 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d,抽濾,大量超純水沖洗后,每瓶菌絲體發(fā)酵生物量以凍干后的重量計。得到的菌絲體分為2組,一組直接用于胞內抗氧化酶系活性分析;另一組真空冷凍干燥,稱量菌絲干重,研碎,保存于干燥器備用。

1.2.2 菌絲體中鎘元素含量測定 參考GB/T 5009.15-2003《食品中鎘的測定的方法》,測定凍干后菌絲體中鎘含量。

1.2.3 菌絲體中可溶性總糖含量測定及菌絲體多糖含量分析 準確稱取凍干的菌絲體20 mg,加入5 mL水,90 ℃震蕩提取2 h,3500 r/min離心10 min,取上清;沉淀加5 mL水重復提取一次,離心合并上清液,定容,采用苯酚-硫酸法測定菌體可溶性總糖含量,0～100 μg/mL的葡萄糖制作標準曲線[6]。

準確稱取凍干的菌絲體10 g,加入100 mL水,90 ℃震蕩提取2 h,3500 r/min離心10 min,取上清;沉淀加100 mL水重復提取一次,離心合并上清液,旋轉蒸發(fā)濃縮至一定體積后加入4倍體積無水乙醇,4 ℃醇沉過夜,5000 r/min離心10 min,取沉淀復溶至一定體積后Savage法除蛋白,取水層凍干,得到菌絲體多糖提取物,復溶至一定體積后采用苯酚-硫酸法測定菌體多糖含量,0～100 μg/mL的葡萄糖制作標準曲線[6]。

1.2.4 菌絲體中CAT、SOD、POD活性及可溶性蛋白含量測定 準確稱取3 g新鮮菌絲,按1∶3的比例加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0),一小勺石英砂,冰浴研磨勻漿,4 ℃冷凍離心(3500 r/min,10 min),取上清液作為CAT、SOD、POD活性及可溶性蛋白質含量的待測液。

1.2.5 數據統(tǒng)計方法 每個實驗至少六次重復,測定結果表達為平均值±標準偏差。使用Microsoft Office Excel 2007和origin7.5進行數據處理、作圖及回歸分析。采用SPSS11.5軟件對數據進行方差分析,差異顯著性水平為α=0.05。

2 結果與討論

2.1 Cd2+對美味牛肝菌菌絲生長的影響

鎘(Ⅱ)對美味牛肝菌菌絲體生長發(fā)育的影響如圖1所示。在無Cd2+培養(yǎng)基中,美味牛肝菌長勢很好,濾出的菌絲體色白,呈明顯且均勻的絲狀。不同濃度Cd2+處理顯著抑制了美味牛肝菌菌絲體的生長發(fā)育(p<0.05),且濾出的菌絲體隨Cd2+濃度的增加顏色呈淡黃至黃褐色。這可能是Cd2+脅迫下,美味牛肝菌菌絲產生了黑色素,來螯合菌體中的Cd2+,提高菌絲體對Cd2+的耐受性[7]。培養(yǎng)結束后,無Cd2+培養(yǎng)基平均每瓶菌絲發(fā)酵產量為0.65 g,隨著Cd2+的加入,菌絲發(fā)酵產量逐漸減少,如圖1所示,本研究與前期研究結果一致[8]。將Cd2+處理濃度(X)與美味牛肝菌菌絲體發(fā)酵產量(Y)進行回歸分析得到Y=-0.0048X+0.592(R2=0.9283),即Cd2+對菌絲體生長發(fā)育的抑制作用與其濃度線性正相關,生長抑制率為50%的Cd2+濃度為56 mg/L,表明美味牛肝菌對Cd2+具有較高的耐受性。

圖1 Cd2+對美味牛肝菌菌絲體生長發(fā)育的影響Fig.1 Effect of Cd2+ on the growth of Boletus edulis注：標注不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.2 菌絲體對Cd2+的生物富集作用

如圖2所示,不同濃度Cd2+的液體培養(yǎng)基中,美味牛肝菌菌絲體對Cd2+的生物富集量呈“S”形曲線變化。由圖2可以看出,隨著培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加,菌絲體對Cd2+的富集量快速上升,其富集系數在Cd2+添加較低濃度時(16 mg/L)達到第一個峰值,為48.8,菌絲對Cd2+的富集量為780.2 mg/kg DW。在培養(yǎng)基中Cd2+濃度為64 mg/L時,菌絲體對Cd2+的富集量達到最大值,為3335.7 mg/kg DW,其富集系數也達到最大值,為52.1,其后,隨培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加,菌絲體對Cd2+的吸附量不再顯著增加,即達到飽和吸附,吸附量為3408.9 mg/kg DW。

根據目前的一些研究,大型真菌在活體生長過程中,菌絲體對培養(yǎng)基質中重金屬的生物吸附性能顯著高于子實體[3,7],但是遠遠低于將采獲后的子實體作為生物吸附劑對基質中重金屬的生物吸附能力[9]。這可能是菌絲體作為子實體的營養(yǎng)體,其與重金屬結合的大分子物質,如多糖、蛋白等含量較高;但是活體培養(yǎng)最終會受到重金屬損傷而產生體內重金屬平衡機制,使其對重金屬的生物吸附具有較低的飽和度。但是以采獲后子實體作為生物吸附劑,處理基質中的重金屬不再受活體的重金屬生理平衡機制的影響,從而具有較高的吸附飽和度。

圖2 美味牛肝菌菌絲發(fā)酵對培養(yǎng)基中Cd2+的生物富集性能Fig.2 Accumulation capacity and bioconcentration factor(BCF)of Cd2+ in Boletus edulis

2.3 Cd2+對菌絲體中可溶性總糖、可溶性蛋白含量及菌體多糖含量的影響

不同濃度Cd2+處理顯著影響了美味牛肝菌菌絲體中可溶性總糖、可溶性蛋白和菌體多糖的含量(p<0.05),如圖3所示。美味牛肝菌菌體中可溶性總糖含量較高,無Cd2+培養(yǎng)的菌絲體中達到25.3% DW;隨著Cd2+的加入及其濃度的增加,菌體中可溶性總糖含量呈現先增加后降低的趨勢,在Cd2+濃度為16 mg/L時,菌體中可溶性總糖含量最高(p<0.05),為33.9% DW,Cd2+濃度為80 mg/L時菌體總糖含量則顯著降低為18.4% DW(p<0.05)。

Cd2+處理對菌體中可溶性蛋白含量的影響與總糖完全相反,由圖3可以看出,隨Cd2+濃度的增加,菌體中可溶性蛋白含量呈現先降低后增加的趨勢,即Cd2+濃度為16 mg/L時菌體中可溶性蛋白含量最低(p<0.05),為0.9 mg/g FW;Cd2+濃度為80 mg/L時菌體可溶性蛋白含量顯著增加為1.6 mg/g FW(p<0.05),相比較于無Cd2+組的1.0 mg/g FW,增加了1.6倍。

Cd2+處理對菌體中多糖含量的影響也呈現先增加后降低的趨勢,相對于可溶性總糖含量,菌體多糖在48 mg/L Cd2+處理時含量最高,為3.9% DW。無Cd2+添加時,菌絲體中多糖含量最低,為2.4% DW,所以培養(yǎng)基中Cd2+的存在刺激了美味牛肝菌菌體多糖的合成。

菌體中可溶性糖類主要包括葡萄糖、果糖、麥芽糖以及能夠在測定條件下水解為單糖的可溶性低聚糖,是菌體細胞中的主要能量物質和滲透調節(jié)物質,可以直接參與菌絲體的新陳代謝,從營養(yǎng)學角度,也是菌體供給人體的主要營養(yǎng)物質和功能性成分;而多糖成分中一部分是菌體的初級代謝產物,一部分是次級代謝產物。重金屬對真菌可溶性總糖含量的影響未見報道,程顯好等[10]研究發(fā)現鋅對蛹蟲草菌體中葡萄糖含量的影響呈先增后降的趨勢,鋅處理量很高時菌體葡萄糖的含量要顯著低于無鋅組;王松華等[11]發(fā)現高濃度鎘處理顯著降低了靈芝菌絲體中還原性糖含量?？赡茉诮饘俣竞ψ饔孟?菌體生長發(fā)育受到抑制,從而抑制了菌體的新陳代謝進程。對此作用機理還有待進一步研究。

菌體多糖如幾丁質、纖維素、纖維素衍生物等細胞成分能結合菌體吸附的重金屬,對菌體抗金屬脅迫的耐受性具有顯著積極作用[7]。另一方面,菌體多糖一般具有顯著的抗氧化活性,可有效清除自由基,維持細胞氧化壓力的平衡。重金屬存在下,可以刺激胞內產生過多的活性氧,增加細胞氧化壓力,對細胞產生毒害。推測,Cd2+刺激美味牛肝菌菌體多糖的合成有助于平衡胞內氧壓。所以,金屬離子的存在一般可以刺激菌體多糖的合成。

重金屬脅迫下,所有的生命體都存在生物轉化來降低重金屬的毒性,如誘導產生金屬硫蛋白、脅迫蛋白來螯合、穩(wěn)定進入體內的重金屬。本研究中,Cd2+處理濃度較高,梯度跨度大,沒有觀察到低劑量的Cd2+對可溶性蛋白的誘導效應,所以可溶性蛋白呈現了先降后增的變化趨勢。對于很高濃度Cd2+處理刺激菌體中可溶性蛋白含量的增加,其機理還有待于進一步研究。

圖3 Cd2+對美味牛肝菌菌絲體中可溶性總糖、可溶性蛋白及菌體多糖含量的影響Fig.3 Effects of Cd2+ on the total soluble saccharides,soluble protein and polysaccharides

2.4 Cd2+對菌絲體中CAT、SOD、POD活力的影響

不同濃度Cd2+處理顯著影響了美味牛肝菌菌絲體中CAT、SOD和POD的活性(p<0.05),如圖4所示。CAT和SOD活性隨Cd2+處理濃度的增加呈現顯著的“低促高抑”變化(p<0.05),Cd2+濃度為16 mg/L時CAT和SOD活性均達到最大值。對于CAT活性,Cd2+處理濃度高于16 mg/L以后,其活性均顯著低于無Cd2+組(p<0.05);對于SOD活性,Cd2+處理濃度高于32 mg/L以后,其活性維持于無Cd2+處理組相當;POD活性被Cd2+顯著抑制(p<0.05)。

鎘脅迫可使生物細胞活性氧水平升高,造成活體細胞的氧壓損傷。生物細胞內的CAT、SOD、PPO等抗氧化酶系可在一定程度上平衡各種環(huán)境因子造成的氧化迸發(fā),降低氧壓損傷,提高生物體抗逆性。重金屬作為生物體不利的環(huán)境因子之一,其脅迫下一般可刺激生物體抗氧化酶系活性升高,清除過量的活性氧,先前研究[11-12]先后報道了鎘脅迫下靈芝、柱狀田頭菇等真菌菌絲體中抗氧化酶系的響應,均可發(fā)現較低鎘濃度處理時對菌體抗氧化酶系的激活作用。推測,菌體抗氧化酶系活性升高,協(xié)同可溶性蛋白、菌體多糖等可提高菌體對重金屬脅迫的耐受性能。本研究中POD活性隨Cd2+處理的顯著降低,可能是本研究中Cd2+處理濃度太大,沒有觀察到Cd2+處理對POD活性的激活作用。

圖4 Cd2+對美味牛肝菌菌絲體中CAT、SOD和POD活性的影響Fig.4 Effects of Cd2+ on the activities of CAT,SOD and POD

3 結論

目前對于生物的金屬離子富集甚至超富集作用機制還不完全了解。從本文和已有研究來看,大型真菌對重金屬具有一定的生物富集作用和耐受性。

菌體中特定的物質成分,如多糖、菌體蛋白等可參與重金屬的吸附,對重金屬脅迫造成的氧化壓力損傷具有一定的修復作用。菌體中的抗氧化酶系可被重金屬脅迫激活,協(xié)同菌體多糖和蛋白等提升菌體對重金屬的耐受性能。重金屬脅迫下大型真菌抗性機理是十分復雜的,其耐受性能可能是由多個基因調控,還需從細胞、分子水平上作進一步研究。

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Bioconcentration characteristics of Cadmium(Ⅱ)byBoletusedulis

LI Jin-cheng,BAO Chang-jun,SUN Yun,ZHUANG Yong-liang*,SUN Li-ping

(Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

The bioconcentration characteristics of cadmium(Ⅱ)with different concentrations(Cd2+,0,16,32,48,64 and 80 mg/L)byBoletusedulisunder liquid fermentation were investigated. The results showed that the treatment with increasing Cd2+concentrations significantly inhibited mycelia growth(p<0.05),and 50% inhibitory concentration was 56 mg/L. Mycelia showed significant accumulation capacity for Cd2+,with the highest content of 3335.7 mg Cd per kg mycelia(DW),and the bioconcentration factor was 52.1(p<0.05). The contents of total soluble sugars and polysaccharides in mycelia were increased firstly and then decreased with increasing Cd2+concentrations. The content of polysaccharides in mycelia treated with Cd2+significantly higher than that of control(p<0.05). Soluble protein contents were decreased firstly and then increased with increasing Cd2+concentrations,with the peak at 80 mg/L Cd2+(p<0.05). The activities of CAT and SOD were significantly increased by lower Cd2+concentrations but inhibited by high Cd2+concentrations(p<0.05). The activities of POD were significantly inhibited by Cd2+treatment(p<0.05).

Boletusedulis;cadmium;bioconcentration;food safety

2015-03-16

李金城(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：340198516@qq.com。

*通訊作者:莊永亮(1981-)，男，博士，教授，主要從事食品高值化利用及質量控制研究，E-mail：kmylzhuang@163.com。

國家自然科學基金項目(21267013)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)23-0068-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.005