雙孢菇漆酶的固定化及其對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯降解的研究

李 飛,夏文靜,周 惠,顧 波

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 生物技術(shù)與化學(xué)工程學(xué)院,江蘇泰州 225300)

雙孢菇漆酶的固定化及其對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯降解的研究

李 飛,夏文靜,周 惠,顧 波

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院 生物技術(shù)與化學(xué)工程學(xué)院,江蘇泰州 225300)

為提高漆酶的利用效率,進(jìn)一步開發(fā)其在環(huán)境治理中的應(yīng)用,以海藻酸鈉為載體,采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)雙孢菇漆酶凝膠包埋固定化的工藝進(jìn)行探討,并利用固定化漆酶對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,采用直接包埋方式,固定化最佳單因素條件為:給酶量160 U/g載體,海藻酸鈉濃度為3%,CaCl2濃度為0.15 mol/L,固定化時(shí)間為2 h,可以獲得較佳的固定化效果。利用固定化漆酶降解DMP時(shí),降解率隨DMP初始濃度的增加而下降,在pH3、4.5對(duì)DMP具有較好的降解效果,在25 mg/L的DMP溶液(pH4.5)中添加小分子介質(zhì)ABTS濃度達(dá)到0.3 mmol/L,投加2 U/g固定化小球反應(yīng)24 h,降解率最高達(dá)到56.9%。研究結(jié)果為處理含DMP污染提供了一種有效的方法和理論基礎(chǔ)。

漆酶,固定化,鄰苯二甲酸二甲酯,降解

鄰苯二甲酸酯類(Phthalic acidester,PAEs)被廣泛用于塑料、農(nóng)藥、化妝品、汽車、服裝、電線電纜等產(chǎn)業(yè)[1-2],是世界上生產(chǎn)量大,應(yīng)用范圍廣的人工合成有機(jī)化合物之一[3]。由于鄰苯二甲酸酯增塑劑并非與樹脂共價(jià)連接,在塑料及其制品中呈游離狀態(tài),穩(wěn)定性較差,極易釋放到環(huán)境中,廣泛存在于大氣、水體、土壤、食品以及生物體內(nèi)[4-6],成為全球最普遍的污染物之一[7-8]。研究表明,PAEs及其降解產(chǎn)物會(huì)引起癌癥并損害腎臟,干擾動(dòng)物及人類的生殖系統(tǒng)和發(fā)育[9-11]。此外,土壤中的PAEs污染對(duì)植物生長(zhǎng)、品質(zhì)和生理生化特征及土壤微生物代謝多樣性和遺傳多樣性產(chǎn)生顯著影響[12-14]。

PAEs在環(huán)境中的自然理化降解十分緩慢,主要依賴生物降解作用[5,15-16]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已就PAEs的微生物降解做了大量的研究,主要集中在篩選高效降解菌株及其降解特性[3,5,9,17]。迄今為止,利用生物酶制劑降解PAEs的報(bào)道較少,有研究報(bào)道幾丁質(zhì)酶和酯酶對(duì)PAEs具有較好的降解效果[18]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,可催化多種酚類及其衍生物、羧酸及其衍生物和非酚類化合物等氧化,因其廣泛的底物特異性,在環(huán)境治理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,能顯著減少排放到環(huán)境中的有毒污染物[19]。而利用真菌漆酶催化降解鄰苯二甲酸酯類還未見報(bào)道。由于漆酶易溶于水,限制了它在實(shí)際中的應(yīng)用。固定化酶可以保持酶高效催化的特點(diǎn),提高酶的穩(wěn)定性,此外,固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開,有利于酶的多次重復(fù),從而提高了酶的使用效率[20]。本實(shí)驗(yàn)選用廉價(jià)的海藻酸鈉作為載體,研究了固定化雙孢菇漆酶的方法及其條件,并以PAEs中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)作為研究對(duì)象,首次利用固定化漆酶對(duì)DMP進(jìn)行降解研究,旨在促進(jìn)漆酶在處理含DMP污染等方面提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漆酶由雙孢菇菌株(Pleurotuseryngii)液態(tài)發(fā)酵法制備,其粗酶液的酶活力為3.5 U/mL。2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡(jiǎn)稱ABTS)購(gòu)自sigma公司,甲醇為色譜純,鄰苯二甲酸二甲酯及海藻酸鈉等試劑均為分析純。

5810型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;UV1000紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;Mili-Q純水系統(tǒng) 美國(guó)Milipore公司;1260型液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漆酶的固定化及固定率的測(cè)定 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的海藻酸鈉和漆酶酶液(3.5 U/mL)按照一定比例混合均勻,用10 mL注射器將海藻酸鈉與漆酶混合液逐滴加入到0.15 mol/L的等體積的CaCl2溶液中,形成光滑的凝膠小球,于4 ℃冰箱中固化2 h后取出洗凈,貯存于4 ℃冰箱中備用。

比較不同單因素對(duì)漆酶固定化的影響,包括固定化時(shí)間(1～4 h,間隔1 h)、海藻酸鈉濃度(0.5%、1%、2%、3%、4%)、給酶量(40、80、120、160、300 U/g絕干載體)及CaCl2濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L)。若無(wú)特殊說明,固定化條件采用:在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為3%,CaCl2濃度為0.15 mol/L,給酶量為160 U/g載體條件下固化2 h。

分別測(cè)定固定化過程中加入游離酶的總活力M0以及固定化后上清液中酶的總活力M1。固定率(%)=(M0-M1)/M0×100。

1.2.2 固定化漆酶對(duì)DMP的降解 以DMP為降解對(duì)象,探索合適的降解條件,包括降解時(shí)間(4、8、12、24、30、48 h)、反應(yīng)pH(3～5,間隔0.5)、DMP濃度(5、10、15、20、25、50 mg/L)、給酶量(1～5 g固定化小球,2 U漆酶活力/g固定化小球)和小分子介質(zhì)ABTS濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mmol/L)。若無(wú)特殊說明,降解條件采用:40 mL反應(yīng)體系含50 mmol/L pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉,DMP(初始濃度為25 mg/L),漆酶酶量(1 g固定化小球,2 U/g固定化小球),30 ℃降解24 h后利用高效液相色譜法測(cè)定DMP含量。用同樣的方法在DMP溶液中以不加入固定化小球作為對(duì)照。以上實(shí)驗(yàn)處理均為3次重復(fù)。

DMP降解率=(ρ0-ρ1)/ρ0×100%,式中,ρ0為降解前DMP質(zhì)量濃度/(mg/L);ρ1為降解后DMP質(zhì)量濃度/(mg/L)。

1.2.3 漆酶活力的測(cè)定 漆酶測(cè)定以2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡(jiǎn)稱ABTS)為底物[21]。3 mL反應(yīng)體系中含有1 mmol/L ABTS底物1 mL,50 mmol/L pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和酶液共計(jì)2 mL,420 nm(ABTS的ε=3.6×104mol/(L·cm))下測(cè)定反應(yīng)液3 min內(nèi)的吸光值變化。一個(gè)酶活力單位定義為在當(dāng)前反應(yīng)條件下每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量。

1.2.4 DMP分析方法 樣品處理:將反應(yīng)液抽濾除去固定化小球,按1∶1向?yàn)V液中加入正己烷,震蕩萃取10 min,收集有機(jī)相,水相再用正己烷萃取2次,合并有機(jī)相,濃縮至5 mL[22]。用安捷倫1260型液相色譜儀測(cè)定DMP含量。

1260型液相色譜儀條件:色譜柱Agilent HC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫40 ℃,流動(dòng)相甲醇∶水=70∶30,流速為1 mL/min。檢測(cè)器波長(zhǎng)為225 nm,進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉凝膠固定漆酶條件優(yōu)化

2.1.1 固化時(shí)間對(duì)漆酶固定率的影響 如圖1所示,漆酶固定率隨著固化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,當(dāng)固化時(shí)間超過2 h后固定率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,可能是因?yàn)镃a2+通過海藻酸鈉膠囊由外向內(nèi)置換Na+形成海藻酸鈣,如果固定化時(shí)間太長(zhǎng),交聯(lián)程度高,導(dǎo)致海藻酸鈣凝膠結(jié)構(gòu)過于緊密,從而影響到酶促反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)速率[20],所以最佳固化時(shí)間選擇為2 h。

圖1 固化時(shí)間對(duì)漆酶固定率的影響Fig.1 Effect of immobilized time on the rate of immobilized laccase

2.1.2 海藻酸鈉濃度對(duì)漆酶固定率的影響 如圖2所示,當(dāng)海藻酸鈉的質(zhì)量濃度為3%時(shí),固定率最高,濃度過高或過低都不利于漆酶的固定化。可能是海藻酸鈉濃度影響凝膠孔徑的大小,濃度過低導(dǎo)致凝膠內(nèi)的酶分子容易流失,而濃度過大導(dǎo)致凝膠孔徑太小,使底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散受到限制[23]。因此,海藻酸鈉載體的最佳濃度為3%。

圖2 海藻酸鈉濃度對(duì)漆酶固定率的影響Fig.2 Effect of concentration of sodium alginateon the rate of immobilized laccase

2.1.3 給酶量對(duì)漆酶固定率的影響 如圖3所示,給酶量對(duì)酶固定率影響顯著,隨著給酶量的增加,固定率逐漸增加,最大值達(dá)到65.7%,當(dāng)給酶量超過每g絕干載體含160 U時(shí),固定率趨于穩(wěn)定?？赡苁钱?dāng)給酶量超過160 U/g載體后,交聯(lián)載體活性基團(tuán)結(jié)合達(dá)到飽和,使得過量的酶呈現(xiàn)游離狀態(tài),無(wú)法固定在載體上[20]。為節(jié)約成本,固化時(shí)給酶量為160 U/g載體較為適宜。

圖3 給酶量對(duì)漆酶固定率的影響Fig.3 Effect of different enzyme amounts on the rate of immobilized laccase

2.1.4 CaCl2濃度對(duì)漆酶固定率的影響 Ca2+作為交聯(lián)劑和海藻酸鈉分子中的-COO-結(jié)合,從而使海藻酸鈉-漆酶復(fù)合液的液滴交聯(lián)固化,形成微球。因此,體系中Ca2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微球的形成和機(jī)械強(qiáng)度也有較大的影響。如圖4所示,隨著CaCl2濃度的增加,固定率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),當(dāng)CaCl2濃度為0.15 mol/L時(shí),對(duì)漆酶的固定率最高。主要原因是當(dāng)CaCl2濃度過小時(shí),海藻酸鈣凝膠固化不充分,凝膠小球孔徑較大,導(dǎo)致漆酶包埋不完全,容易流失;而CaCl2濃度過高,使固定化小球的交聯(lián)程度變強(qiáng),導(dǎo)致小球的空隙減少,影響物質(zhì)的傳質(zhì)[20]。因此,固化時(shí)CaCl2最佳濃度為0.15 mol/L。

圖4 CaCl2濃度對(duì)漆酶固定率的影響Fig.4 Effect of concentration of CaCl2 on the rate of immobilized laccase

2.2 固定化漆酶對(duì)DMP的降解

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化漆酶降解DMP的影響 如圖5所示,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),固定化漆酶對(duì)DMP的降解逐漸增加,當(dāng)超過24 h后,對(duì)DMP的降解作用變得緩慢,可能是固定化酶經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間作用穩(wěn)定性降低,且凝膠小球機(jī)械強(qiáng)度下降,導(dǎo)致酶活力下降,從而降解作用減弱。因此,選擇最佳降解時(shí)間為24 h。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)漆酶降解DMP的影響Fig.5 Effect of time on DMP degradation byimmobilized laccase

2.2.2 反應(yīng)pH對(duì)固定化漆酶降解DMP的影響 如圖6所示,在pH3～4范圍內(nèi),固定化酶對(duì)DMP的降解率隨著pH的增大而減小;而pH4～5范圍內(nèi),對(duì)DMP的降解呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。不同pH條件下,底物與漆酶的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性改變,影響與DMP的親和力,從而影響降解效果[24]。對(duì)雙孢菇漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該漆酶最適反應(yīng)pH為3,酶活力隨著pH的增大而減小,在30 ℃,pH3條件下處理24 h,酶活力喪失52.3%,而在pH4～5條件下處理24 h漆酶仍保持90%以上的活力,表明該漆酶在pH4～5條件下具有較好的穩(wěn)定性,這與固定化酶對(duì)DMP的降解結(jié)果一致,在pH3、4.5具有較好的降解率。

圖6 反應(yīng)pH對(duì)漆酶降解DMP的影響Fig.6 Effect of pH value on DMP degradation by immobilized laccase

2.2.3 固定化酶用量對(duì)固定化漆酶降解DMP的影響 如圖7所示,DMP的降解效果隨著酶用量的增大而增大,在酶用量達(dá)到1 g固定化小球時(shí),DMP的降解率達(dá)到26.2%,繼續(xù)增大酶用量,降解效果反而下降?？赡苁敲赣昧吭蕉?反應(yīng)體系內(nèi)凝膠小球越擁擠,使固定化酶不能充分結(jié)合底物,從而降低了固定化酶對(duì)DMP的作用。

圖7 固定化酶用量對(duì)漆酶降解DMP的影響Fig.7 Effect of immobilized laccase amout on DMP degradation

2.2.4 DMP濃度對(duì)固定化漆酶降解DMP的影響 如圖8所示,固定化酶對(duì)DMP的降解率隨著DMP濃度的增加而顯著下降。DMP濃度在5～15 mg/L之間時(shí),具有較好的降解效果,降解率均在40%以上?？赡苁歉邼舛鹊腄MP對(duì)固定化漆酶產(chǎn)生了較大的毒性,大部分漆酶在失活之前沒有參與催化反應(yīng),導(dǎo)致對(duì)DMP的降解率下降[25]。綜合考慮催化效率及污染實(shí)際情況,本研究采用較大的DMP濃度25 mg/mL為研究對(duì)象。

圖8 DMP濃度對(duì)漆酶降解的影響Fig.8 Effect of different initial DMP concentration on DMP degradation

2.2.5 小分子介質(zhì)(ABTS)濃度對(duì)固定化漆酶降解DMP的影響 漆酶在一些小分子氧化還原介體的協(xié)助下具有更強(qiáng)的催化氧化能力,擴(kuò)大漆酶對(duì)底物的作用范圍[26]。由于小分子介質(zhì)價(jià)格昂貴,濃度過高會(huì)產(chǎn)生有毒的衍生物,本實(shí)驗(yàn)選擇在反應(yīng)體系中添加較低濃度的ABTS,結(jié)果如圖9所示。小分子介質(zhì)ABTS的加入能顯著增強(qiáng)固定化酶對(duì)DMP的降解,降解率隨著ABTS濃度的增加而增加。當(dāng)ABTS濃度為0.3 mmol/L時(shí),對(duì)DMP的降解率達(dá)到56.9%,與不加ABTS相比,降解率增加了一倍。可能是小分子介質(zhì)ABTS作為電子載體,克服了阻礙漆酶與DMP直接作用的空間結(jié)構(gòu)的影響,從而提高催化效率[27]。

圖9 ABTS濃度對(duì)漆酶降解DMP的影響Fig.9 Effect of ABTS concentration on DMP degradation by immobilized laccase

3 結(jié)論與討論

鄰苯二甲酸酯類有機(jī)化合物污染問題是全球共同關(guān)注的問題之一,美國(guó)環(huán)境保護(hù)署和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站已先后將該類污染物列為優(yōu)先控制的污染物[22]。自然環(huán)境中鄰苯二甲酸酯完全礦化的主要依賴于微生物降解,但歸根結(jié)底取決于微生物代謝過程中所分泌的降解酶類。近年來(lái),鄰苯二甲酸酯的生物降解方面有一些研究,主要集中在對(duì)鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選及降解途徑,曾峰等[28]從處理石化廠廢水的活性污泥中分離出1株鄰苯二甲酸酯降解菌FS 1,對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯具有高效降解作用。金雷等[29]從長(zhǎng)期受食品塑料垃圾污染的土壤中通過富集培養(yǎng)和分離純化,獲得一株DBP高效降解菌H-2能高效降解短鏈鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯和DBP,而對(duì)長(zhǎng)鏈鄰苯二甲酸二辛酯的降解效果較差。盡管在篩選降解有效微生物方面取得了不錯(cuò)的進(jìn)展,但利用關(guān)鍵酶對(duì)鄰苯二甲酸酯進(jìn)行降解的研究較少。Kim等[18]報(bào)道利用幾丁質(zhì)酶和酯酶對(duì)各類鄰苯二甲酸酯進(jìn)行純酶降解的比較研究,發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解更具高效性,且降解產(chǎn)物無(wú)毒。漆酶由于其獨(dú)特的作用機(jī)理,可催化多種酚類和非酚類化合物氧化,在環(huán)境治理領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和深入的研究,利用真菌漆酶催化降解鄰苯二甲酸酯類還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究了雙孢菇漆酶的固定化工藝,并利用固定化漆酶對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯進(jìn)行降解,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明漆酶的適宜固定化條件為給酶量160 U/g載體,海藻酸鈉濃度為3%,CaCl2濃度為0.15 mol/L,固定化時(shí)間為2 h。在上述條件下,利用固定化漆酶降解DMP,可知固定化漆酶在pH3、4.5,DMP濃度在5～15 mg/L范圍內(nèi)具有較好的降解效果,降解率均高于40%。最佳降解時(shí)間為24 h,適宜給酶量為1 g固定化小球,當(dāng)添加小分子介質(zhì)ABTS時(shí)能顯著促進(jìn)漆酶對(duì)DMP的降解,且降解率隨ABTS濃度的增加而提高,當(dāng)DMP濃度為25 mg/mL,添加ABTS濃度為0.3 mmol/L時(shí),最高降解率達(dá)到56.9%。

研究表明固定化漆酶對(duì)DMP具有一定的降解效果,顯示漆酶在處理含DMP污染方面存在一定的應(yīng)用潛力,研究結(jié)果與金德才等[22]報(bào)道的利用細(xì)菌JDC-3降解DMP的降解率相似,但與曾峰[28]等報(bào)道的利用FS 1降解DMP,降解率在24 h內(nèi)達(dá)到100%相比,本研究利用漆酶對(duì)DMP的降解效果并不高,還需要進(jìn)行大量長(zhǎng)期的研究工作。

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Immobilization of laccase fromAgaricusbisporusand the degradation of dimethyl phthalate

LI Fei,XIA Wen-jing,ZHOU Hui,GU Bo

(College of Biochemical Engineering,Nanjing Normal University Taizhou College,Taizhou 225300,China)

In order to improve the utilization efficiency and explore the application of laccase in environmental governance,the immobilization process of the laccase fromAgaricusbisporusin sodium alginate gel spheres and the degradation of dimethyl phthalate(DMP)using the immobilized enzyme were investigated by single-factor experiments. According to the research,the best efficiency of immobilization was obtained by using the direct embedding method when the enzyme dosage was 160 U/g carrier,the concentration of sodium alginate was 3%,the concentration of CaCl2was 0.15 mol/L and the immobilized time was 2 h. The degradation rate of DMP was decreased with the improvement of the initial concentration of DMP. In a initial pH of 3 and 4.5,the DMP has a good degradation effect. At a initial DMP concentration of 25 mg/L(pH4.5),the degradation rate of DMP reached 56.9% within 24 h,with 2 U/g the amount of immobilized enzyme-ball and 0.3 mmol/L of ABTS as redox mediator added. The research provided an efficient way and theoretical basis for DMP waste treatment.

laccase;immobilization;dimethyl phthalate;degradation

2015-03-25

李飛(1986-)，男，碩士，講師，主要從事天然產(chǎn)物的開發(fā)、酶工程、基因工程，E-mail：kasber-lee@163.com。

泰州市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(TS019、TS201337)；南京師范大學(xué)泰州學(xué)院青年項(xiàng)目(Q201242)；2015年江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(15KJB220004)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.028