貝酵母耐硫相關(guān)基因FZF1的克隆與分析

賀 笑,張先昂,劉小珍,李升星,張漢堯

(西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650224)

貝酵母耐硫相關(guān)基因FZF1的克隆與分析

賀 笑,張先昂,劉小珍,李升星,張漢堯*

(西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650224)

FZF1基因在釀酒酵母中對(duì)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因SSU1具有正向調(diào)節(jié)作用,但在貝酵母中尚無相關(guān)報(bào)道,本研究擬通過對(duì)該基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析為后續(xù)研究做出參考。首先對(duì)貝酵母FZF1基因進(jìn)行克隆,并利用在線分析工具ProtParam、ProtScale、TMHMM、PredictProtein、Swiss-Model等軟件對(duì)其編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析,同時(shí)預(yù)測(cè)了該基因所編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:該核苷酸序列含有一個(gè)長(zhǎng)900 bp的開放閱讀框,可編碼299個(gè)氨基酸;編碼的蛋白質(zhì)為在細(xì)胞核中行使調(diào)控功能的親水蛋白,含有18個(gè)絲氨酸(S)激酶潛在磷酸化位點(diǎn)、一個(gè)Coil區(qū)和4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,與釀酒酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)極為相似?？沙醪秸J(rèn)為貝酵母FZF1基因與細(xì)胞的耐硫性相關(guān);而貝酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)中僅有4個(gè)鋅指,則可能是貝酵母硫耐受能力比釀酒酵母弱的重要原因。

貝酵母,FZF1,序列分析,耐硫基因

葡萄酒生產(chǎn)過程中,需要多種抗氧化劑的作用,抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),從而保證葡萄酒的品質(zhì)與風(fēng)味,亞硫酸作為最常見的一種抗氧化劑,廣泛用于釀酒工藝[1-2]。然而,過高濃度的亞硫酸會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒害作用[3]。亞硫酸鹽會(huì)直接破壞細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu),它能與膜受體結(jié)合,阻礙細(xì)胞膜正?；顒?dòng)[4],導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流[5];與ATP酶結(jié)合,影響細(xì)胞中ATP的合成[6];與葡萄糖、丙酮酸等代謝產(chǎn)物結(jié)合,阻礙細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)[7-8]。所以在釀酒工藝中,亞硫酸鹽的耐受能力也成為篩選釀酒菌株的重要指標(biāo)之一。

釀酒酵母中,SSU1編碼的蛋白SSU1p可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的硫代謝[9-10],而在硫代謝過程中,酵母菌會(huì)產(chǎn)生亞硫酸鹽,這是一種具有潛在毒性的中間代謝產(chǎn)物[11-12],與耐硫相關(guān)的基因SSU1(Sulfite sensitivity protein,SSU1)在細(xì)胞調(diào)節(jié)中可作為“硫泵”,將對(duì)細(xì)胞具有毒害作用的亞硫酸鹽泵出細(xì)胞外,在保證細(xì)胞正常生命活動(dòng)的同時(shí),也形成了釀酒過程中酒品的特殊風(fēng)味,從而提高了葡萄酒的品質(zhì)。而與釀酒酵母耐硫相關(guān)的另一個(gè)基因FZF1(Five zine finger,FZF1)在“泵硫”過程中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。FZF1被發(fā)現(xiàn)在SSU1的轉(zhuǎn)錄過程中起著正向調(diào)節(jié)的作用。即在釀酒酵母硫代謝過程中,SSU1基因編碼的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞的亞硫酸鹽代謝,過量的亞硫酸鹽可以通過亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外,而正向調(diào)節(jié)基因FZF1可加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽的輸出量[13],從而提高酵母的硫耐受性,進(jìn)而也可提高釀造葡萄酒中芳香物質(zhì)硫醇的含量,最終達(dá)到提高葡萄酒品質(zhì)的目的。

表1 進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的軟件、網(wǎng)址及內(nèi)容

貝酵母與釀酒酵母同屬于狹義釀酒酵母屬,二者在各性狀上都極為相似,但在“長(zhǎng)相思”等酒種釀造工藝后期,貝酵母在無氧呼吸產(chǎn)生酒精方面具有更為重要的作用[14-16]。在貝酵母中,張?zhí)萚17]對(duì)耐硫相關(guān)基因SSU1進(jìn)行了初步的分析。作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因SSU1轉(zhuǎn)錄過程中的正向調(diào)節(jié)基因FZF1,更具有分析研究的重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)貝酵母FZF1基因進(jìn)行克隆,測(cè)序分析,再借助多種在線分析工具對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了詳細(xì)的分析及預(yù)測(cè),從而探討貝酵母的FZF1基因在“泵硫”的過程中是否具有釀酒酵母FZF1基因?qū)SU1基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正向調(diào)節(jié)的相同作用。為后期進(jìn)一步研究貝酵母硫代謝的詳細(xì)途徑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 香格里拉縣奔子欄鄉(xiāng)葡萄分離得到的貝酵母菌株BZL5;酵母膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、TIANamp Yeast DNA Kit、RNase A、Lyticase、山梨醇 TIANGEN公司;Loading Buffer、核酸染料 Bioteke Corporation;DNA Marker Ⅶ 莊盟生物有限公司;100 bp Ladder DNA Marker Biomed公司;Taq 酶(5000U)、dNTP(10 mM) NEB北京分公司;引物 生工生物工程(上海)股份有限公司。

DK98-1數(shù)顯恒溫水浴 天津泰斯特儀器有限公司;Centrifuge 5810R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;PYX-DHG-9023-A干燥箱 上海新諾儀器設(shè)備有限公司;TP650 PCR儀 日本TaKaRa公司;Pico17 小型離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;DYY-10C電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司;GBOXHR 凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Syngene公司;溫控?fù)u床 德國(guó)Sartorius;YXQ-LS-75SII滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化工程公司;移液槍 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貝酵母基因組DNA的獲得 利用酵母基因組DNA提取試劑盒提取高質(zhì)量的樣品DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 貝酵母FZF1基因的擴(kuò)增 利用Primer Premier5,確定了上游引物Primer FZF1L1:5′ TACGGGTTGACCACTCCAAT 3′、下游引物Primer FZF1R1:5′ CTCAAGTTGGTACCACCCAA 3′。

進(jìn)行PCR擴(kuò)增:25 μL體系為:5 μL高質(zhì)量DNA,1 μL Primer FZF1L1,1 μL Primer FZF1R1,2.5 μL 10×PCR Buffer,0.3 μL Taq酶,0.4 μL dNTP,14.8 μL ddH2O。

PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72 ℃最后延伸7 min,4 ℃forever。PCR產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.2.3 貝酵母FZF1基因的測(cè)序與分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI,利用Open Reading Fame Finder工具查找這條核苷酸序列中的開放閱讀框。預(yù)測(cè)該核苷酸序列所翻譯的蛋白質(zhì),然后利用在線分析工具對(duì)所預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、Coil區(qū)、結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析,最后預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。具體分析內(nèi)容如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝酵母基因組DNA及PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

將提取獲得的貝酵母基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖1。1、2、3、4、5、6號(hào)菌株均提出質(zhì)量較好的基因組DNA。

圖1 貝酵母基因組DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of genomic DNA from S. bayanus

確定提取得到貝酵母基因組DNA后,擴(kuò)增貝酵母FZF1基因,PCR檢測(cè)結(jié)果見圖2。3號(hào)、5號(hào)菌株擴(kuò)增出了FZF1基因片段。

圖2 FZF1基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of FZF1 gene

表2 貝酵母FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成及親疏水性

2.2 貝酵母FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

將PCR結(jié)果測(cè)序后得到一條長(zhǎng)為1603 bp的核苷酸序列。利用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì),只有兩條巴斯德酵母的序列與之同源性比例為5%和4%,說明該序列是一條新基因序列。然后再利用Open Reading Fame Finder工具查找這條核苷酸序列中的開放閱讀框。根據(jù)六種不同的編碼方式得到的結(jié)果顯示,該基因序列中含有一個(gè)長(zhǎng)度為900 bp的開放閱讀框,位于基因的563～1462 bp之間,可能與遺傳信息的表達(dá)密切相關(guān)。該段CDS區(qū)可以翻譯成一條含有299個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),繼而得到其氨基酸序列,見圖3。

圖3 貝酵母FZF1基因編碼的蛋白質(zhì)序列Fig.3 The protein sequence encoded by the FZF1 gene of S.bayanus

2.2.1 理化性質(zhì)分析 將氨基酸序列提交到在線分析工具ExPASy ProtParam中,對(duì)該蛋白質(zhì)序列的組分及基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:該蛋白質(zhì)的分子式為C1520H2345N431O468S13,分子質(zhì)量為34561.7,理論pI值為6.80,氨基酸組成和每個(gè)氨基酸的親疏水性分值見表2。氨基酸組成上Ser有33個(gè),所占比例為11%,Leu有32個(gè),所占比例為10.7%,這兩種氨基酸含量相對(duì)較高,其他氨基酸比例相差不大。不穩(wěn)定系數(shù)為48.05,所以該蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為69.46,總平均親水性為-0.812,為親水蛋白。

2.2.2 疏水性分析 利用ProtScale進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性分析,見圖4。根據(jù)20種氨基酸疏水特性的參數(shù),較高正值的氨基酸具有較強(qiáng)的疏水性,而較低負(fù)值的氨基酸具有較強(qiáng)的親水性[18]。由圖可知,根據(jù)正負(fù)分值比例,此預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)屬于親水蛋白。ProtScale圖形輸出顯示該蛋白質(zhì)最高分值峰為1.344,最低分值峰為-3.100,不存在高分值(Scare>1.5)峰,所以該蛋白質(zhì)可能沒有潛在的跨膜區(qū)。在36、99、120、140、193、243、248氨基酸位點(diǎn)附近的分值分別為-2.578、-2.678、-2.056、-1.456、-1.778、-2.233、-2.311,這些區(qū)域?qū)儆诟哂H水性,可能在這些位點(diǎn)存在折疊情況。

圖4 貝酵母FZF1基因編碼的蛋白質(zhì)的親疏水性Fig.4 Hydrophobicty of protein encoded by the FZF1 gene of S.bayanus

2.2.3 蛋白質(zhì)信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 組成生物體的蛋白質(zhì)大多數(shù)是在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上合成的,各種蛋白質(zhì)合成之后要分別運(yùn)送到細(xì)胞中的不同部位,以保證細(xì)胞生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。有些蛋白質(zhì)要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),最終成為分泌蛋白;有的蛋白質(zhì)則需要穿過各種細(xì)胞器的膜,進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi),構(gòu)成細(xì)胞器蛋白。分泌蛋白的N端都有一段約15～35個(gè)氨基酸的疏水性肽端,其功能是引導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入腔內(nèi),稱為信號(hào)肽[19]。由前文蛋白質(zhì)的親疏水性分析顯示,該蛋白質(zhì)為水溶性蛋白,應(yīng)無信號(hào)肽,SignalP 3.0 server 分析結(jié)果與預(yù)測(cè)一致。

亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì)的功能存在著非常密切的聯(lián)系。通過TargetP在線軟件分析該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位,結(jié)果如圖5(a)。該蛋白質(zhì)在線粒體存在的可能性為0.136,在分泌通路存在的可能為0.064,而在其他位置的可能性為0.908,即該蛋白質(zhì)很有可能存在于除線粒體和分泌通路以外的位置。進(jìn)一步用SPORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,使用k-NN近鄰算法,結(jié)果如圖5(b),該蛋白質(zhì)主要分布在細(xì)胞核中,可能性為95.7%,也有可能在線粒體中出現(xiàn),可能性僅為4.3%。由此可知,該蛋白質(zhì)很有可能為一種在細(xì)胞核中進(jìn)行代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。

圖5 FZF1編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of protein encoded by the FZF1 gene注:a圖為TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果;b圖為PSORT預(yù)測(cè)結(jié)果。

2.2.4 激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè) 氨基酸翻譯后通常會(huì)加入一些生物化學(xué)官能團(tuán),使其在化學(xué)性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化,被稱為蛋白質(zhì)翻譯后修飾。其中磷酸化是將一個(gè)磷酸基團(tuán)導(dǎo)入一個(gè)有機(jī)分子。此作用在生物化學(xué)中占有重要地位。蛋白質(zhì)的磷酸化可發(fā)生在許多種類的氨基酸上,其中以絲氨酸為多,接著是蘇氨酸。而酪氨酸和組氨酸則相對(duì)較少的磷酸化發(fā)生。通過KinasePhos在線分析工具來預(yù)測(cè)此蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)和修飾激酶,為了減少假陽(yáng)性率,當(dāng)限定值為90%時(shí),在線提交蛋白質(zhì)序列,對(duì)四種蛋白質(zhì)進(jìn)行勾選,預(yù)測(cè)結(jié)果如表3,含有18個(gè)絲氨酸(S)激酶潛在磷酸化位點(diǎn)。這些激酶磷酸化位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)修飾加工后的功能行使具有重要的意義。

表3 FZF1編碼蛋白質(zhì)的激酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

注:S指激酶磷酸化位點(diǎn)。

2.3 貝酵母FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.1 Coil區(qū)分析 卷曲螺旋是蛋白質(zhì)中由2～7條α螺旋鏈互相纏繞形成類似麻花狀結(jié)構(gòu)的總稱。目前已發(fā)現(xiàn)的天然卷曲螺旋的主要存在形式為由2～5條α螺旋鏈相互纏繞而形成的平行或反平行同寡聚體或異寡聚體[20]。卷曲螺旋式控制蛋白質(zhì)寡聚化的元件,含有卷曲結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)主要是一些轉(zhuǎn)錄因子、骨架蛋白、動(dòng)力蛋白等,在機(jī)體內(nèi)執(zhí)行這分子識(shí)別、代謝調(diào)控、細(xì)胞分化等生物學(xué)功能。利用COILS在線分析工具,基于Lupas算法,預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的卷曲螺旋,如圖6所示,該蛋白質(zhì)殘基在3個(gè)不同窗口(Window 14、21、28)均顯示卷曲螺旋區(qū)域,文本數(shù)值(未列出)結(jié)果顯示,卷曲螺旋序列位于104～117區(qū)域框內(nèi)。

圖6 FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的Coil區(qū)分析Fig.6 Coil area analysis of protein encoded by the FZF1 gene

2.3.2 跨膜區(qū)分析 通過TMPRED、TMHMM在線軟件分析該蛋白質(zhì)的跨膜螺旋區(qū),未發(fā)現(xiàn)可能的跨膜螺旋區(qū),即該蛋白質(zhì)不跨膜。通常蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū),即可能作為膜受體、錨定蛋白或離子通道蛋白,均不溶于水,所以該預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)為水溶性蛋白。這與蛋白質(zhì)的親疏水性性質(zhì)一致。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7,沒有跨膜區(qū)信號(hào)。

圖7 FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析Fig.7 Transmembrane domains of protein encoded by the FZF1 gene

2.3.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用PredictProtein在線分析平臺(tái)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)表明,FZF1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以環(huán)(loop)為主,高達(dá)67.22%,其次是螺旋(helix),占有31.77%,僅含有1%的折疊(sheet)。

2.4 貝酵母FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域

2.4.1 結(jié)構(gòu)域分析 結(jié)構(gòu)域是在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中介于二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的可以明顯區(qū)分但又相對(duì)獨(dú)立的折疊單元,每個(gè)結(jié)構(gòu)域自身形成緊實(shí)的三維結(jié)構(gòu),可以獨(dú)立存在或折疊。使用SMART在線服務(wù)器分析該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域,結(jié)果如圖8。整個(gè)氨基酸序列中,在第12～36位、第42～66位、第72～94位、第246～273位氨基酸位點(diǎn)出分別存在一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域。在第216～213位氨基酸位點(diǎn)處存在一個(gè)組成低復(fù)雜序列區(qū)。

鋅指結(jié)構(gòu)域是一種相當(dāng)小的蛋白模體,通過許多類似手指狀的突出物與靶分子相聯(lián)系,這些區(qū)域大多數(shù)情況下會(huì)結(jié)合鋅離子,但時(shí)常也會(huì)與其他的金屬離子相結(jié)合。許多情況下,一些家族成員會(huì)通過構(gòu)成鹽橋使類似手指狀的折疊更加堅(jiān)固。鋅指結(jié)構(gòu)域能夠與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等相結(jié)合,綁定特征依氨基酸序列的不同而有所差異。在不斷的進(jìn)化過程中,鋅指結(jié)構(gòu)域已經(jīng)形成了穩(wěn)固的支架結(jié)構(gòu)。不僅在形成蛋白質(zhì)的折疊等方面發(fā)揮作用,而且對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具有重要意義。C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域作為這個(gè)家族中最經(jīng)典的結(jié)構(gòu)類型,由一個(gè)短的β折疊和一個(gè)α螺旋形成四面體結(jié)構(gòu),在真核生物中,它作為轉(zhuǎn)錄因子,與DNA或RNA特異性結(jié)合,從而對(duì)基因的表達(dá)起著抑制或增強(qiáng)的作用。在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí),含有31.77%的螺旋結(jié)構(gòu),可能就是構(gòu)成鋅指結(jié)構(gòu)域的重要結(jié)構(gòu)。

圖8 FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析Fig.8 Structure domain analysis of protein by the FZF1 gene

2.4.2 motif搜索 模體是序列中局部的保守區(qū)域,或者是一組序列中共有的一小段序列模式。一般指構(gòu)成任何一種特征序列的基本結(jié)構(gòu),但多數(shù)情況下是指可能具有分子功能、結(jié)構(gòu)性質(zhì)或家族成員相關(guān)的任何序列模式。模體作為結(jié)構(gòu)中的亞單元,表現(xiàn)結(jié)構(gòu)域的各種生物學(xué)功能。

利用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行motif搜索,結(jié)果如圖9。該蛋白質(zhì)中有3處與指定的模板相匹配,具體為第12～36位、第42～66位、第72～94位的氨基酸序列分別存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,這與SMART在線服務(wù)器分析結(jié)果相一致。FZF1基因編碼的蛋白質(zhì)可能是通過這3個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域與SSU1基因特異性結(jié)合,從而增強(qiáng)了SSU1基因的表達(dá)。

圖9 FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的motif分析Fig.9 Motif analysis of protein encoded encoded by the FZF1 gene

圖10 FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Three-dimensional structure prediction of protein encoded by the FZF1 gene

2.5 貝酵母FZF1基因編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用同源建模的網(wǎng)絡(luò)綜合服務(wù)器Swiss-Model Workspace對(duì)貝酵母FZF1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型見圖10,由在線分析的結(jié)果可知:貝酵母FZF1基因編碼的蛋白質(zhì)基于數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到的模型,比對(duì)建模,一致性達(dá)到42.62%。由模型評(píng)估結(jié)果可知,基于QMEANscore4記分值估算,可信度為0.54,表示模型質(zhì)量中等偏高,較可信。下載PDB圖片,利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可視化工具Swiss-PdbViewer對(duì)預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖進(jìn)行修飾分析,見圖11,預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,與前文結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)基本一致。該預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)主要由無規(guī)則卷曲和螺旋結(jié)構(gòu)組成,與前文二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)相呼應(yīng)。

圖11 Swiss-Pdb Viewer修飾下的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.11 The three-dimensional structure modified by Swiss-Pdb Viewer

2.6 貝酵母與釀酒酵母所編碼蛋白質(zhì)序列的比對(duì)

將貝酵母預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)序列和釀酒酵母預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)利用MEGA 5.05進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果如圖12。分別比對(duì)了含有299個(gè)氨基酸的序列,其中保守氨基酸有192個(gè),差異氨基酸107個(gè),一致率為64.21%。

圖12 貝酵母與釀酒酵母所編碼蛋白質(zhì)序列的比對(duì)結(jié)果Fig.12 Alignment results of protein sequence coded by S. cerevisiae and S.bayanus

3 討論

本研究首次對(duì)貝酵母FZF1基因進(jìn)行了克隆分析,結(jié)果顯示該核酸序列可以編碼一條含有299個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子式為C1520H2345N431O468S13,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,屬于親水性蛋白,沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中發(fā)揮作用,含有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域,二級(jí)結(jié)構(gòu)中以環(huán)(loop)為主,其次是螺旋結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)也基本與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符。

貝酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)序列雖然與釀酒酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)序列比對(duì)后一致率為64.21%,但是兩者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異不甚明顯。釀酒酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)也是典型的親水性蛋白,沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用,氨基酸序列中有一處Coil區(qū),唯一有差異的是,釀酒酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)中含有五個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域,而貝酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)中僅有4個(gè)。鋅指結(jié)構(gòu)域的主要作用是與DNA結(jié)合而行使基因調(diào)控的作用,釀酒酵母FZF1基因與SSU1基因結(jié)合,從而可調(diào)節(jié)酵母亞硫酸鹽的耐受能力[3]。鋅指結(jié)構(gòu)域的多少可能與酵母對(duì)亞硫酸鹽耐受能力的強(qiáng)弱相關(guān)。而貝酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)中僅有4個(gè)鋅指,則可能是貝酵母硫耐受能力比釀酒酵母弱的重要原因。蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的特殊功能,在具有相似結(jié)構(gòu)的前提下分析推測(cè),貝酵母FZF1基因與釀酒酵母FZF1基因可能具有相似的功能,與酵母亞硫酸鹽的耐受能力相關(guān)。Tomoko[21]和Iijima[22]等先前就認(rèn)為貝酵母SSU1基因編碼的蛋白質(zhì)可能具有亞硫酸鹽“鹽泵”的功能,進(jìn)而可以推測(cè)與之相關(guān)的FZF1基因也與亞硫酸鹽“鹽泵”相關(guān),而有關(guān)貝酵母FZF1基因則還沒有相關(guān)的報(bào)道。當(dāng)然,本文推測(cè)結(jié)論還需要后續(xù)進(jìn)行功能確證等進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)貝酵母FAF1基因的克隆與分析,得出該基因包含一條長(zhǎng)度為900 bp的開放閱讀框,編碼一條含有299個(gè)氨基酸親水蛋白,該蛋白主要以無規(guī)則卷曲為主,含有四個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,在細(xì)胞核中行使功能。與釀酒酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果一致性達(dá)64.21%,結(jié)構(gòu)上主要區(qū)別在于,比釀酒酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì)少一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,這可能是貝酵母耐硫性稍遜色的重要原因。

亞硫酸在葡萄酒的釀造和品質(zhì)形成過程中,起著至關(guān)重要的作用。但是由于亞硫酸鹽對(duì)細(xì)胞的毒害作用,所以對(duì)硫的耐受能力成為篩選釀酒菌株的重要指標(biāo)之一。本研究通過生物信息學(xué)分析的知識(shí)初步預(yù)測(cè)了貝酵母FZF1基因所編碼的蛋白質(zhì),并對(duì)該蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)做出了詳細(xì)的預(yù)測(cè),為貝酵母FZF1基因的進(jìn)一步研究和貝酵母硫耐受性的更深層次探索做出了一定的參考。

[1]陳葉福,沈世超,王艷,等. SSU1多拷貝表達(dá)對(duì)釀酒酵母二氧化硫生成量的影響[J]. 微生物學(xué)報(bào),2008,48(12):1609-1615.

[2]Taylor S L,Higley N A,Bush R. Sulfites in food:uses,analytical methods,residues,fate,exposure assessment,metabolism,toxicity,and hypersensitivity[J]. Adv. Food Res,1986,30:1-7.

[3]Avram D,Leid M,Bakalinsky A T. Fzflp ofSaccharomycescerevisiaeis a positive regulator of SSU1 transcription and its first zinc finger region is required for DNA binding[J]. Yeast,1999,15:473-480.

[4]Divol B,du Toit M,Duckitt E. Surviving in presence of sulphur dioxide:strategies developed by wine yeasts[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2012,95(3):601-613.

[5]Hinze H,Holzer H. Analysis of the energy metabolism after incubation ofSaccharomycescerevisiaewith sulfite or nitrite[J]. Arch Microbiol,1986,145(1):27-31.

[6]Hinze H,Holzer H. Effect of sulfite or nitrite on the ATP content and the carbohydrate metabolism in yeast[J]. Z Lebensm Unters Forsch,1985,181(2):87-91.

[7]Schimz KL,Holzer H. Rapid decrease of ATP content in intact cells ofSaccharomycescerevisiaeafter incubation with low concentrations of sulfite[J]. Arch Microbiol,1979,121(3):225-229.

[8]Rankine B C,Pocock K F. Influence of yeast strain on binding of sulphur dioxide in wines,and on its formation during fermentation[J]. J Sci Food Agric,1962,20(2):104-109.

[9]Park H,Bakalinsky. SSU1 mediates sulphite efflus in Sacharomyces cerevisiae[J]. Yeast,2000(16):881-888.

[10]Tiziana N,Viviana C,Alessio G,et al. A sulphite-inducible

form of the sulphite efflux gene SSU1 in aSaccharomycescerevisiaewine yeast[J]. Microbiology,2010,156(6):1686-1696.

[11]Avram D,Bakalinsky A T. SSU1 encodes a plasma membrane protein with a central role in a network of proteins conferring sulfite tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J]. Bacteriol,1997,179(18):5971-5974.

[12]Donalies U E B,Stahl U. Increasing sulphite formation inSaccharomycescerevisiaeby overexpression of MET14 and SSU1[J]. Yeast,2002,19:475-484.

[13]Breitwieser W,Price C,Schuster T. Identification of a gene encoding a novel zinc finger protein inSaccharomycescereviaiae[J]. Yeast,1993(9):551-556.

[14]王慶國(guó),劉天明. 酵母菌分類學(xué)方法研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志,2007,27(3):96-101.

[15]Ciani M E,Kerala(India),Sipiczki M. Taxonomic and physiological diversity of saccharomyces bayanus,in biodiversity and biotechnology of wine yeasts[M]. Research Signpost,2002,53-69.

[16]Naumov G I,Naumova E S,Martynenko N N and Masneuf-Pomaréde I. Taxonomy,ecology,and genetics of the yeast saccharomyces bayanus:a new object for science and practice[J].Mikrobiologiya,2011,80(6):723-730.

[17]張?zhí)?朱方明,劉小珍，等. 貝酵母SSU1基因的克隆與分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2014,14(9):195-199.

[18]閻隆飛,孫之榮. 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[M]. 北京:清華大學(xué)出版社,1999:17-18.

[19]劉雅婷,李正躍,朱有勇，等. 植物病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato基因組中的信號(hào)肽分析[J]. 遺傳,2005,27(6):959-964.

[20]魏香,曾憲綱,周海夢(mèng). 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中卷曲螺旋的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2004,20(5):565-571.

[21]Tomoko F. Functional analysis of SSU1 genes in lager brewing yeast[J]. Bioscience & Industry,2003,61(12):809-810.

[22]Iijima K,Ogata T. Construction and evaluation of self-cloning bottom-fermenting yeast with high SSU1 expression[J]. Journal of Appl Microbiology,2010,109(6):1906-1913.

Cloning and sequence analysis of theFZF1 gene concerning sulfur tolerance fromSaccharomycesbayanus

HE Xiao,ZHANG Xian-ang,LIU Xiao-zhen,LI Sheng-xing,ZHANG Han-yao*

(Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province,Southwest Forestry University,kunming 650224,China)

TheFZF1 gene ofSaccharomycescerevisiaewas found to be a positive regulator ofSSU1 transcription,but there was no report about theFZF1 gene ofSaccharomycesbayanus. In this study,the genes were cloned and the content of bioinformatics was analyzed by online tools for setting the foundation of the further research. Here theFZF1 gene ofS.bayanuswas cloned and the physical and chemical properties ofFZF1 protein were analyzed by online analytical tools,such as ProtParam,ProtScale,TMHMM,PredictProtein and Swiss-Model. At the same time,the protein secondary structure and tertiary structures were predicted. The results indicated that theFZF1 gene contained an opening reading frame(ORF)of 900 bp encoding a 299 predicted amino acids. The protein was a hydrophilic protein exercising their control functions in the nucleus. It contained 18 serine kinase potential phosphorylation sites,a coil domain and 4 zinc finger domains. The protein encoded byFZF1 gene ofS.cerevisiaewas very similar with the predicted protein. So theFZF1 gene ofS.bayanuswas inferred to be associated with the sulfur resistance. And the protein encoded by theFZF1 gene ofS.bayanusonly contains 4 zinc finger domains. It was one of the most important reasons that the sulfur tolerance of mostS.bayanuswas weaker than mostS.cerevisiae.

Saccharomycesbayanus;FZF1;sequencing analysis;sulfur tolerance gene

2015-02-12

賀笑(1991-),女,在讀碩士,研究方向:林業(yè)生物技術(shù),E-mail:smile1165279688@sina.com。

*通訊作者:張漢堯(1975-),男,博士,教授,研究方向:植物和微生物分子遺傳,E-mail:hanyaoz@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360404);教育部歸國(guó)人員啟動(dòng)基金項(xiàng)目(212209)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0166-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.026