指紋圖譜和主成分分析法評價不同海拔高度的桔梗藥材質(zhì)量

黃 嬌

(重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校,重慶萬州 404120)

指紋圖譜和主成分分析法評價不同海拔高度的桔梗藥材質(zhì)量

黃 嬌

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校,重慶萬州 404120)

目的:對不同海拔高度桔梗藥材質(zhì)量進行分析與綜合評價。方法:采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法,KinetexC18色譜柱(4.6mm×100mm,5μm);流動相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫;流速0.4mL·min-1;并對其進行聚類和主成分分析。結(jié)果:建立了不同海拔高度桔梗藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜,共有峰為8個,相對峰面積有不同程度的變化。聚類分析為2大類,主成分分析選出3個主因子。結(jié)論:該方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性,為有效控制桔梗藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

桔梗,海拔高度,HPLC-ELSD,指紋圖譜,聚類分析,主成分分析

桔梗(Radix platycodi)為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.的干燥根,在我國藥用歷史悠久,具有宣肺、利咽、祛痰和排膿之效[1]。桔梗是藥食兩用的藥材品種,用于治療咳嗽痰多,胸悶不暢,咽痛,音啞,肺癰吐痰,瘡瘍膿成不潰等癥[2]。近年來海內(nèi)外學者對桔梗中多種成分,特別是三萜皂苷類成分的藥理活性進行了較多研究[3-5]。桔梗的主要化學成分為齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷,桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D[6]等,桔梗皂苷 D是桔梗皂苷中的主要皂苷[7],藥典用其作為定量測定的主要指標。指紋圖譜針對中藥多組分、多靶點的特點,從“全成分”角度進行質(zhì)量控制,它是一種綜合的,可量化的鑒別模式,能有效檢測和控制中藥產(chǎn)品的真實性、質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性[8]。文獻主要研究不同產(chǎn)地與不同采收期的桔梗藥材指紋圖譜[9-12],但不同海拔高度桔梗藥材的指紋圖譜未見報道。桔梗在重慶各地區(qū)均有種植,三峽庫區(qū)氣候適宜,病蟲害較少,栽培技術成熟,地形復雜且變化多樣,各個海拔高度都有,從丘陵到高山,海拔高差大,立體氣候明顯。目前三峽地區(qū)桔梗大多種植在500～1500m處。本實驗采用HPLC-ELSD法,結(jié)合桔梗對照品桔梗皂苷D,建立不同海拔高度的桔梗藥材指紋圖譜,并采用主成分分析法和聚類分析進行藥材質(zhì)量綜合評價,以期為桔梗藥材的質(zhì)量控制提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔梗皂苷D對照品 中國藥品生物制品檢定所,批號為:111851-201204,含量94.9%;乙腈 色譜純;甲醇、甲酸，分析純 川東化工集團有限公司化學試劑廠;超純水 自制。

本實驗桔梗藥材樣品采自2013年開縣、萬州、奉節(jié)等地不同海拔高度(見表1)共12批,藥材采集后清洗去除泥沙,刮去根皮后干燥,即得桔梗樣品,并經(jīng)重慶萬州食品藥品檢驗所孟家安教授鑒定為桔?？平酃僦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.的根。

島津LC-20A高效液相色譜儀ELSD-LTII檢測器 島津工作站 日本島津公司;KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;ME215S十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;梅特勒CP224S萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;超聲波清洗儀SD3200 昆山市超聲儀器有限公司;LK-COOA搖擺式高速中藥粉碎機 山東省青州市精誠醫(yī)藥裝備有限公司。

表1 桔梗藥材藥品來源Table 1 The origin of Platycodon grandiflorum

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:KinetexC18色譜柱(4.6mm×100mm,5μm);流動相:流動相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫(表1);流速:0.4mL·min-1;進樣量:20μL。

實驗過程中,考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水-2%磷酸0.1%磷酸水-甲醇、乙腈-0.05%磷酸水溶液四組流動相系統(tǒng)[9-12],并對洗脫程序進行優(yōu)化。結(jié)果表明,乙腈-0.1%甲酸洗脫系統(tǒng)所得色譜峰峰形最好,分離度良好,基線分離,峰形對稱,所有組分70min內(nèi)被洗脫。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定桔梗皂苷D對照品5.65mg,置于10mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,過0.45μm微孔濾膜濾過即得,進樣20μL。

1.2.3 供試品溶液的制備 取桔梗藥材粉末(過二號篩)精密稱定2g,置錐形瓶中,精密加入50%甲醇25mL,超聲提取30min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足重量,濾過,取續(xù)濾液,過0.45μm微孔濾膜濾過即得,進樣20μL。實驗中以水、不同比例的甲醇、乙醇,超聲提取方法對提取時間15、30、45min進行比較。結(jié)果表明以50%甲醇25mL超聲處理30min,樣品提取效果好,且操作簡便。

表2 指紋圖譜流動相線性梯度表 Table 2 The linear gradient elution of mobile phase for HPLC fingerprints

1.2.4 系統(tǒng)適應性實驗 在1.2.1項下色譜條件對對照品進行測定,記錄色譜圖。

1.2.5 色譜柱考察 比較了phenoenex-C18,KinetexC18,Sepax BR-C18。結(jié)果表明以上色譜柱均能使主要色譜峰得到較好分離。

1.2.6 測定方法的選擇 文獻中用HPLC-UV,HPLC-ELSD分別建立了桔梗藥材指紋圖譜[9-12],桔梗藥材主要含有甾體及皂苷類化合物,在紫外區(qū)末端吸收或不吸收,ELSD檢測器為通用型檢測器,適合檢測無紫外吸收或弱紫外吸收的物質(zhì)成分,故選擇HPLC-ELSD法。

1.2.7 指紋圖譜方法學考察

1.2.7.1 精密度實驗 取同一批次桔梗樣品溶液(1號),按1.2.1項下條件連續(xù)進樣6次,記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.7.2 重復性實驗 取同一批次桔梗樣品溶液(1號)共6份,按1.2.1項下條件分別進樣20μL,記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.7.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批次桔梗樣品溶液(1號),分別在0、2、4、6、8、12、24h檢測,記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔梗指紋圖譜的測定

指紋圖譜方法學考察中精密度實驗中各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值結(jié)果顯示,RSD均<3%,表明精密度良好。重復性實驗中各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值結(jié)果顯示,RSD均<3%,表明重復性良好。穩(wěn)定性實驗中各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值結(jié)果顯示,RSD均<3%,表明供試品溶液在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 各批樣品材共有峰的相對峰面積Table 3 Relative peak area of HPLC fingerprint common peaks

分別取不同海拔高度的12批桔梗藥材,按1.2.3項下方法制備供試品溶液,分別進樣20μL,記錄HPLC-ELSD色譜圖。

圖1 桔梗皂苷D對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of platycodin-D reference substance

圖2 桔梗藥材樣品色譜圖Fig.2 The chromatograms for Platycodon grandiflorum

2.2 指紋圖譜共有模式的建立

將藥材指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版),設定匹配模版,進行譜峰自動匹配,并生成對照指紋圖譜,結(jié)果見圖3、圖4。12批桔梗樣品生成的對照指紋圖譜,有8個共有峰,通過與對照品對照,指認7號峰為桔梗皂苷D(t=37.78min)。

圖3 12批桔梗藥材HPLC-ELSD指紋圖譜Fig.3 HPLC-ELSD fingerprints of 12 samples of Platycodon grandiflorum

圖4 桔梗藥材的HPLC-ELSD對照指紋圖譜Fig. 4 Reference fingerprint of Platycodon grandiflorum注：7-桔梗皂苷D

2.3 共有峰的標定

12批樣品共有峰相對保留時間、相對峰面積范圍分別見表3。

2.4 指紋圖譜的相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004年A版”軟件進行數(shù)據(jù)處理:以相關系數(shù)(中位數(shù))代表其相似度,與不同海拔高度桔梗藥材生成的對照指紋圖譜(共有模式)比較,12批桔梗藥材的相似度見表1。

由表1看出可知,桔梗藥材不同海拔的指紋圖譜相似度在0.888～0.972之間,說明不同海拔高度的桔梗藥材所含化學成分和質(zhì)量分數(shù)有不同程度的變化。從圖3看出,圖譜中主要峰群的基本面貌基本一致,但成分量的相對值有所不同,說明藥材質(zhì)量受產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境等因素影響,藥材質(zhì)量評價要結(jié)合不同因素進行綜合考慮。

2.5 聚類分析

利用 SPSS 19.0軟件對12批不同海拔高度的桔梗藥材進行聚類分析,采用組間聯(lián)接法,利用歐氏距離(Eucildean Dis-tance)作為樣品的測度對其進行系統(tǒng)聚類分析,得到聚類樹狀圖見圖5。

圖5 聚類分析樹狀圖Fig.5 Dendrogram of cluster

結(jié)果顯示:12批桔梗藥材最終歸為一類,可以分為A、B兩大類,其中A 類分為A1和A2 類,S2、S5、S4、S12、S10聚為A1類,樣品海拔跨度為800～1250m,S8、S6聚為A2類,樣品海拔高度相差900m,S7、S3、S11、S1、S9聚為B類,樣品海拔跨度500～1450m。海拔相同的S4和S10可以歸為一類,而海拔相同的S1和S12卻未歸為一類,提示可能奉節(jié)和開縣兩地的氣候有所差異,溫度、光照等對桔梗質(zhì)量有一定的影響,需進一步研究其相關性。

2.6 主成分分析

主成分分析(principal component analysis,PCA)是最常用的多指標線性降維壓縮和多變量分析方法。它可將原有眾多具有一定相關性的變量,重新組合成一組新的、相互無關的綜合指標來代替原有的變量,從而實現(xiàn)以最少的主成分盡可能多的體現(xiàn)原變量的信息[13]。

本實驗以12批桔梗樣品的指紋圖譜的共有峰為分析數(shù)據(jù)源,利用指紋圖譜共有峰峰面積描述樣品的特征,應用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行主成分分析(分析結(jié)果見表4、表5)。

表4 主成分方差分析Table 4 Analysis of variance for PCA

圖6 樣本在3個主成分的平面分布圖Fig.6 Samples in the planar distribution of 3 main components

從表4中可以看出前3個主成分特征值均大于1,累計貢獻率為84.819%,可以表征原始因子代表的全部信息,故選取前3個主成分進行分析。并根據(jù)因子負荷矩陣,推測影響桔梗差異成分的并不是單個成分,而是多成分(群)[14]的協(xié)同作用的結(jié)果。從表5可以看出,第一主成分中的信息主要來自色譜峰3、4、5、6、7;第二主成分主要來自色譜峰2、3、8;第三主成分主要反映峰1的信息。從圖6以X軸為例,在投影圖中選取距離原點較遠的幾個點,分別是F7、F3、F8、F5(即7、3、8、5號峰),7號(桔梗皂苷D)、3號(未知)、8號(未知)、5號(未知)得到主成分中變量的權(quán)重值分別為0.975、0.96、0.92、0.90,權(quán)重值越大表明該成分在決定樣品區(qū)分中的作用越大。這4個成分在區(qū)分不同海拔高度的桔梗指紋圖譜中占決定性作用,具體的成分有待于進一步研究。

從表6可以得到原8項指標的線性組合,根據(jù)各個主成分的得分,得到12批不同海拔高度桔梗藥材的綜合分析評價函數(shù):C=(47.047×C1+24.375×C2+13.398×C3)/84.819,總因子得分C得分越高,表明質(zhì)量越好。

表5 成分矩陣Table 5 Component matrix

表6 不同海拔高度桔梗藥材主成分因子得分排序Table 6 Different altitudes of platycodon grandiflorum principal component factor score sorting

汪云偉等[15]利用PCA綜合得分評價了益母草的質(zhì)量,安開龍[16]等利用PCA綜合得分評價了不同干燥方法對五味子藥材品質(zhì)的影響,薛敏等[17]利用PCA綜合評分評價了不同品種的獼猴桃游離氨基酸的質(zhì)量。由于中藥及其復方制劑成分較復雜,現(xiàn)階段的質(zhì)量控制方法包括性狀鑒別等方法均存在一定的局限性,在有些情況下并不能對中藥質(zhì)量做出合理準確的判斷。而主成分分析法在中藥領域的應用彌補了中藥質(zhì)量優(yōu)劣評價中各指標權(quán)重的不確定性及某些指標間存在的相關性帶來的不便,進一步完善了中藥質(zhì)量評價方法[18]。也有學者對主成分分析綜合得分法提出質(zhì)疑[19],文獻只揭示了方法不可靠性的存在,并沒有提出解決方法[20]。從中藥的整體性和質(zhì)量評價方面來看,主成分分析法由于具有以最少的信息丟失為代價將眾多的變量濃縮為少數(shù)幾個變量,主成分分析法對鑒別和評價中藥材及其飲片的質(zhì)量以及中藥種質(zhì)資源的優(yōu)選,具有重要的科學價值和實際意義[18]。

在沒有找到更優(yōu)的評價方法之前,本實驗也選取PCA綜合評分評價不同海拔高度的桔梗藥材質(zhì)量。因此,從綜合評價得分上得出12批桔梗藥材以S6(開縣1500m)的桔梗藥材最佳,S3(奉節(jié)1450m)次之,開縣得分S6(1500m)>S5(1200m)>S4(800m),奉節(jié)得分S3>S2>S1(1450m>1250m>1000m),萬州得分S12>S11>S10>S9>S8>S7(1000m>900m>800m>700m>600m>500m)。整體來看,3個地區(qū)的桔梗藥材質(zhì)量都隨著海拔高度升高而質(zhì)量越佳。說明海拔高度對桔梗質(zhì)量有影響。桔梗的主要成分是皂苷,符合文獻研究表明[14,21-22]皂苷含量與海拔高度之間存在及顯著相關關系,其某些器官中的總皂苷含量也可以達到顯著差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 分析方法評價

本實驗采用HPLC-ELSD方法建立桔梗藥材指紋圖譜,由于生長環(huán)境、土壤性質(zhì)等原因,其化學成分和質(zhì)量分數(shù)之間有所不同,表現(xiàn)在色譜圖上是某些峰位的差異。主成分分析法能夠篩選出共有的特征成分,指導發(fā)現(xiàn)決定性要素。本實驗中,選出的特征成分未知,需要結(jié)合質(zhì)譜等手段進一步確定。運用PCA-CA方法,多元模式識別分析多指標的指紋圖譜信息能更全面、綜合、準確地判別藥材的真?zhèn)闻c優(yōu)劣,可以作為桔梗藥材質(zhì)量檢測的一種手段。

3.2 實驗結(jié)果分析

本實驗選擇種植年限、采集時間、加工方法、入藥部分(根)等方面比較一致的12批桔梗樣品來建立HPLC-ELSD指紋圖譜,從12批桔梗藥材的特征指紋圖譜中找到了8個共有峰,不同海拔高度桔梗的指紋圖譜較為吻合,桔梗的有效成分桔梗皂苷在色譜圖中能充分體現(xiàn),但相對峰面積有一定的差異,且藥材成分也有所不同。以共有模式圖譜為對照,12批樣品相似度在 0.888～0.972之間,說明不同海拔高度的桔梗藥材所含化學成分和質(zhì)量分數(shù)有不同程度的變化。利用PCA法,找到 F3、F5、F7、F8四個主要決定特征峰。但本次實驗的主成分因子分析累積方差貢獻率沒有達到90%以上,下一步需做特征峰的含量測定及水分、總灰分等項目的測定,把桔梗藥材的主要影響成分深入研究,更好、更全面的評價該藥材質(zhì)量。從主成分分析綜合得分評價中表明開縣1500m的桔梗質(zhì)量最優(yōu),整體來看,3個地區(qū)的桔梗藥材質(zhì)量都隨著海拔高度升高而質(zhì)量越佳。不同海拔高度日照、溫度變化有差異,從而影響到桔梗的桔梗皂苷體內(nèi)生物合成及代謝。在同一地域不同海拔高度采集的藥材質(zhì)量得分、指紋圖譜均有差異,也許和海拔不同有一定的關系,提示海拔也有可能影響藥材的質(zhì)量。

3.3 研究方向展望

桔梗是一種具有較高的食用和藥用價值的植物資源,有較好的臨床應用價值和研發(fā)潛力,可結(jié)合液相質(zhì)譜聯(lián)用等進一步鑒別其它特征峰。桔梗皂苷含量與光照、積溫、降水等之間的具體關系還有待進一步研究。

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Quality evaluation ofPlatycodongrandiflorumfrom different altitude by PCA and fingerprint

HUANG Jiao

(ChongQing Three Gorges Medical College,Wanzhou 404120,China)

Objective:To analysis and comprehensive evaluation ofPlatycodongrandiflorumfrom different altitude and evaluate its quality. Methods:HPLC-ELSD was performed using a KinetexC18column(4.6mm×100mm,5μm). with gradient elution of acetonitrile(A)-0.1% formic acid(B)at the flow rate of 0.4mL·min-1,and the clustering and principal component analysis. Results:The HPLC-ELSD fingerprint of RadixPlatycodongrandiflorumin different altitude were established and it had 8 characteristic common peaks,the relative peak area had different degrees of change. Clustering analysis for two categorys,the principal component analysis to select 3 main factor. Conclusion:This method had good repeatability and stability,and can be used for quality evaluation control ofPlatycodongrandiflorum.

Radix platycodi;height above sea leve;HPLC-ELSD;fingerprint;cluster analysis;principal component analysis

2014-09-09

黃嬌(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：中藥質(zhì)量評價。

重慶市教委科學技術研究項目(K131801)；重慶市科技攻關項目(CSTC,2011AC5062)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)13-0309-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.056