全水化無醇提取γ聚谷氨酸工藝的研究

喬長晟,張苗苗,劉曉晨,高明昊,林虹秀,樓 鵬

(1.天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457；2.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司,天津 300457；3.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

喬長晟1,2,張苗苗1,劉曉晨3,高明昊1,林虹秀1,樓 鵬2

(1.天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457；2.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司,天津 300457；3.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

為實(shí)現(xiàn)γ-聚谷氨酸無醇提取,利用板框除菌,酶解除大分子多糖,活性炭脫色,超濾除小分子雜質(zhì),最后冷凍干燥獲得γ-聚谷氨酸(γ-PGA)成品。確定了全水化無醇提取條件:下罐調(diào)pH6.0,發(fā)酵液稀釋2倍;硅藻土和紅土配比為2∶1(m∶m),總添加量為1.5%(w/v),除菌率97%以上;脫色條件:活性炭添加量1.5%(w/v)、溫度30℃、pH5、時(shí)間60min。超濾選擇10ku的膜包除雜并最終濃縮至原液的1/9。冷凍干燥18h得到的γ-聚谷氨酸純度達(dá)90%。無醇提取工藝的探索為工業(yè)生產(chǎn)提取γ-PGA提供了重要參考依據(jù)。

γ-PGA,除菌,無醇提取,脫色,純化

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種天然存在的聚合物,是由L型和D型谷氨酸(Glu),通過γ-谷氨酰胺鍵聚合而成的均聚氨基酸,由于γ-PGA中的Glu有兩個(gè)羧基,所以它有兩種異構(gòu)體:α-PGA和γ-PGA,生物合成的均為γ-PGA,即Glu單體通過α-氨基和γ-羧基形成的酰胺鍵連接;而化學(xué)合成的聚谷氨酸則為α-PGA。γ-PGA具有良好的吸水性能、生物相容性、生物降解性和無毒害性,可作為化妝品添加劑、保水劑、高吸水樹脂、重金屬吸附劑、食品添加劑、醫(yī)藥載體、組織工程材料等廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、合成纖維和涂膜等領(lǐng)域[1-3]。

用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA已成為γ-PGA商業(yè)化的主要方法,發(fā)酵生產(chǎn)多采用有機(jī)溶劑絮凝方法提取,在工業(yè)生產(chǎn)中提取費(fèi)用很高并且提取環(huán)境危險(xiǎn)。一般工藝中發(fā)酵液提取多聚合物的主要方法為多次醇析聚沉法,即醇析-復(fù)溶-醇析的方法將產(chǎn)物提取出來,有機(jī)溶劑的使用在工業(yè)提取上比較廣泛,但人為添加的有機(jī)溶劑對(duì)產(chǎn)物有一定影響。目前,文獻(xiàn)報(bào)道優(yōu)化好的γ-PGA提取工藝提取步驟為:γ-PGA發(fā)酵液——酸化稀釋除菌——硅藻土過濾——超濾——鹽析-醇析——真空干燥——γ-PGA成品[4-5],其中,酸化除菌體會(huì)降解γ-PGA,造成其降解損失,醇析步驟添加量為4倍溶液體積,使用乙醇較多,其他文獻(xiàn)報(bào)道,用其他有機(jī)溶劑如異丙醇代替乙醇[6],均未減少有機(jī)溶劑的使用。

本論文研究一種不添加有機(jī)溶劑提取γ-PGA的全水化提取工藝,結(jié)合粉末活性炭脫色技術(shù)和膜分離技術(shù),為實(shí)現(xiàn)γ-PGA產(chǎn)業(yè)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮發(fā)酵液γ-PGA,為黃褐色液體,濃度為34g/L,pH7.2,由天津北洋百川生物技術(shù)有限公司通過10L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵得到并提供;白色硅藻土、紅土 嵊州市華力硅藻土制品有限公司;活性炭 福建芝星炭業(yè)有限公司;糖化酶 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;牛血清蛋白、硫酸、苯酚 國產(chǎn)分析純。濾布1100目 天臺(tái)華南濾布廠。

SBA-40E生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所;板框過濾裝置 實(shí)驗(yàn)室自制;ML204型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán);梅特勒FE20K型PH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán);抽濾裝置 實(shí)驗(yàn)室自制;電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán);超濾設(shè)備 合肥信達(dá)膜科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 除菌 下罐發(fā)酵液調(diào)pH6.0,利用板框過濾裝置進(jìn)行除菌,操作壓力0.12MPa。測定除菌率和γ-PGA損失率,對(duì)發(fā)酵液稀釋倍數(shù)(1.0、1.5、2.0、2.5倍),白色硅藻土和紅土的添加配比(2∶0、1∶1、1∶2、2∶1),以及硅藻土(白色硅藻土和紅土)添加總量(質(zhì)量m占發(fā)酵液體積v比重:1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)進(jìn)行優(yōu)化,從而確定板框除菌最佳條件。

1.2.2 酶解及蛋白變性 選用諾維信糖化酶,按照酶的最適條件將大分子多糖酶解成小分子糖,酶解條件:pH5.5,55℃,酶添加量為:0.1mL酶液/L除菌上清液,酶解40min。結(jié)束后,進(jìn)行蛋白變性,迅速升溫至80℃,保溫30min。

1.2.3 脫色 選用亞甲基藍(lán)吸附值17.5的活性炭進(jìn)行脫色,對(duì)脫色條件進(jìn)行優(yōu)化:溫度20、30、40、50、60、70℃;活性炭添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%;脫色最適pH:2、3、4、5、6、7;脫色時(shí)間30、40、50、60、80、100min。確定最優(yōu)條件后,在此條件下,確定清液初始色素濃度(用OD值來反應(yīng)色素濃度),使在此濃度下脫色率最高且γ-PGA得率最高。

1.2.4 超濾提純 使用超濾裝置對(duì)脫色后的清液進(jìn)行除雜,同時(shí)對(duì)γ-PGA進(jìn)行提純,篩選膜包10ku和30ku,條件為:常溫,進(jìn)口壓0.14MPa,出口壓0.07MPa。定義每100mL清液添加100mL蒸餾水進(jìn)行循環(huán)超濾至100mL,稱為一次循環(huán)超濾。檢測保留液谷氨酸含量、色素含量、電導(dǎo)率、γ-PGA濃度和總糖;檢測透過液中的谷氨酸含量、色素含量、電導(dǎo)率和總糖。SBA檢測谷氨酸含量,苯酚硫酸法檢測總糖含量,OD440檢測色素的含量。

1.2.5 真空冷凍干燥 取經(jīng)提純濃縮后γ-PGA的清液,鋪于平板中,厚度約為0.7cm,放于-80℃冰箱中預(yù)凍,過夜。然后將平板置于真空冷凍干燥設(shè)備中干燥,調(diào)定冷阱溫度-65℃,真空度-0.09Mpa,干燥時(shí)間18h,得到白色γ-PGA樣品。

1.3 分析方法

1.3.1 谷氨酸檢測 采用SBA-40E生物傳感分析儀測定谷氨酸濃度[6]。

1.3.2 γ-PGA含量檢測 取清液加入4倍體積的無水乙醇沉淀產(chǎn)物,棄上清加適量蒸餾水復(fù)溶沉淀至原體積,檢測水解前后谷氨酸的含量,前后的差值即為γ-PGA含量[7-10]。

1.3.3 色素濃度測定 利用紫外分光光度計(jì)在440nm測定吸光度[11]。

1.3.4 電導(dǎo)率檢測 每次均取相同體積(10mL)的待測液,利用電導(dǎo)率儀進(jìn)行測定[12]。

1.3.5 總糖測定 采用蒽酮-硫酸法進(jìn)行測定[13-14]。

1.3.6 蛋白測定 采用Bradford法進(jìn)行測定[15]。

1.3.7 菌體濃度測定 將待測液稀釋適當(dāng)濃度,利用紫外分光光度計(jì)在660nm測定吸光度[16]。

1.3.8 除菌率的計(jì)算方法:

計(jì)算公式如下:

式(1)

式中：Y1:除菌率;OD1:原液稀釋25倍后OD660吸收值;OD2:處理后清液稀釋25倍OD660吸收值。

1.3.9 γ-PGA損失率和γ-PGA得率的計(jì)算方法

γ-PGA損失率計(jì)算公式如下:

式(2)

式中：Y2:γ-PGA損失率,%;m1:處理前溶液中γ-PGA的濃度,(g/L);m2:處理后溶液中γ-PGA的濃度,(g/L)。

γ-PGA得率的計(jì)算公式如下:

式(3)

式中：Y3:γ-PGA得率,%;c0:處理后溶液中γ-PGA的濃度,(g/L);c:原溶液中γ-PGA的濃度,(g/L)。

1.3.10 脫色率計(jì)算方法 脫色率計(jì)算公式如下:

式(4)

式中：Y4:γ-PGA發(fā)酵液的脫色率,%;A:脫色前γ-PGA發(fā)酵液的色素含量(OD值);A0:脫色后γ-PGA發(fā)酵液的色素含量(OD值)。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 除菌條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵液稀釋倍數(shù)對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響 首先考察了稀釋倍數(shù)對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響,由圖1可以清晰地看出,隨著稀釋倍數(shù)的增加,除菌率逐漸降低,當(dāng)發(fā)酵液稀釋倍數(shù)小于2.0時(shí),除菌率均在97%以上,其中,稀釋倍數(shù)為2.0時(shí),除菌率為97.21%,而當(dāng)稀釋倍數(shù)大于2.0時(shí),除菌率嚴(yán)重下降;觀察γ-PGA損失率,隨著稀釋倍數(shù)的增加,γ-PGA損失率呈下降趨勢,當(dāng)稀釋倍數(shù)為2.5時(shí),達(dá)到最低。綜合考慮,選擇除菌率較高,γ-PGA損失率較低的稀釋倍數(shù),應(yīng)選擇稀釋倍數(shù)為2.0進(jìn)行除菌。

圖1 稀釋倍數(shù)對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響Fig.1 Effect of dilution on pretreatment fermentation liquor

2.1.2 白色硅藻土和紅土的配比對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響 在板框過濾除菌的過程中,設(shè)定硅藻土總添加量為1.5%(w/v)時(shí),對(duì)白色硅藻土和紅土配比進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅土目數(shù)較白色硅藻土細(xì),并且吸附效果優(yōu)于硅藻土,在白色硅藻土與紅土配比為2∶1時(shí),除菌率達(dá)最高值,之后除菌率沒有明顯變化,但γ-PGA損失率升高,故選擇白色硅藻土與紅土配比為2∶1,此時(shí)除菌率達(dá)96.35%,γ-PGA損失率較低。

圖2 硅藻土紅土的配比對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響Fig.2 Effect of different ratio of diatomite added on pretreatment fermentation liquor

2.1.3 硅藻土總添加量對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響 選定白色硅藻土與紅土配比為2∶1時(shí)進(jìn)行除菌實(shí)驗(yàn),由圖3可知,當(dāng)助濾劑總添加量為1.5%(w/v)時(shí),菌體的去除率較高,達(dá)97.27%,總添加量再增加時(shí),除菌率變化不大,但γ-PGA損失率也逐漸升高,這是由于過量的硅藻土形成的濾餅層比較致密,增大了γ-PGA損失率。

圖3 硅藻土總添加量對(duì)發(fā)酵液預(yù)處理的影響Fig.3 Effect of diatomite added on pretreatment fermentation liquor

圖4 脫色溫度、添加量、pH和時(shí)間對(duì)脫色率的影響Fig.4 Effect of temperature,adding quantity, pH,and time on the decolourization ratio注:a:脫色溫度對(duì)脫色率的影響;b:活性炭添加量對(duì)脫色率的影響;c:清液pH對(duì)脫色率的影響;d:脫色時(shí)間對(duì)脫色率的影響。

綜上所述,確定了板框過濾除菌的最優(yōu)條件:發(fā)酵液稀釋倍數(shù)2.0,白色硅藻土∶紅土配比2∶1,其總添加量1.5%(w/v),除菌率97%以上。

2.2 活性炭脫色條件優(yōu)化

2.2.1 脫色條件對(duì)脫色效果的影響 由圖4a可知,當(dāng)溫度在30℃時(shí),脫色率達(dá)最高點(diǎn),隨著溫度繼續(xù)升高,脫色率明顯下降;由圖4b可知,脫色率隨著活性炭添加量的升高而升高,當(dāng)添加量到達(dá)1.5%(w/v)時(shí),脫色率為78.72%,當(dāng)添加量到達(dá)2.0%(w/v)時(shí),脫色率為79.19%,脫色率升高趨勢不明顯,之后略有下降;由圖4c可知,pH為5.0時(shí),具有最佳的脫色效果,pH>5.0或pH<5.0脫色率均會(huì)降低;由圖4d可知,隨著脫色時(shí)間延長脫色率的變化趨勢為先升高后略有降低后又升高,說明在時(shí)間為60min時(shí),脫色率達(dá)到飽和點(diǎn),當(dāng)時(shí)間大于60min后,隨著時(shí)間的延長,脫色率略有細(xì)微的變化,推測原因?yàn)榛钚蕴课斤柡秃髮⑻幱谝欢ǔ潭葍?nèi)的動(dòng)態(tài)平衡,造成脫色率略有差別。

綜上所述,最優(yōu)的脫色條件為:活性炭添加量1.5%(w/v)、溫度30℃、pH5.0、時(shí)間60min。

2.2.2 初始上清顏色對(duì)脫色效果的影響 粉末活性炭吸附原理既有物理吸附也有化學(xué)吸附,活性炭多孔結(jié)構(gòu)提供了大量的表面積,達(dá)到吸附雜質(zhì)的目的,活性炭孔壁上的大量分子也可以產(chǎn)生強(qiáng)大的引力,使雜質(zhì)被吸引到孔徑中,通過改變?cè)牧虾突罨瘲l件來使活性炭有不同孔徑結(jié)構(gòu),從而適用于不同雜質(zhì)吸收[17]。選用的亞甲基藍(lán)吸附值17.5的活性炭可以吸附清液中大量色素、蛋白和多糖,同時(shí)也會(huì)吸附少量的γ-PGA。為了得到較好的脫色效果,同時(shí)兼顧γ-PGA得率,因此本實(shí)驗(yàn)在最佳脫色條件下對(duì)初始色素濃度進(jìn)行篩選。

如圖5顯示,當(dāng)清液初始OD440為0.344時(shí),脫色率最高,達(dá)83.38%,此時(shí),γ-PGA得率為90.37%,脫色后清液γ-PGA的含量為6.1g/L,此時(shí)脫色后OD440為0.064,脫色效果最佳,γ-PGA得率最高。

圖5 脫色率和γ-PGA得率與OD440分析圖Fig.5 The analysis of the relationship of decolourization ratio and receiving rate

2.3 超濾提純條件優(yōu)化

通過實(shí)驗(yàn)室制備的γ-PGA分子量在300ku以上,經(jīng)過上述步驟處理后,含有小分子雜質(zhì),如小分子蛋白、多糖、無機(jī)鹽、色素及其他小分子可溶物。利用超濾中不同分子量膜包截留作用,將這些雜質(zhì)除掉,并達(dá)到濃縮的目的。選用10ku膜包和30ku膜包循環(huán)超濾進(jìn)行除雜效果對(duì)比,結(jié)果如圖6～圖9。

分析保留液,圖6中結(jié)果顯示,選用10ku膜包對(duì)清液進(jìn)行超濾,在第4次超濾時(shí),總糖和電導(dǎo)率的下降趨勢減小,OD440和谷氨酸(Glu)為0,說明小分子雜質(zhì)已全部被洗出,且γ-PGA損失較小,在第5次超濾時(shí),γ-PGA損失了9.83%,但第6次時(shí)γ-PGA損失較第4次并沒有明顯增加,可推斷第5次γ-PGA濃度下降是檢測誤差導(dǎo)致,并非損失。γ-PGA在第2、3、4次超濾時(shí)損失沒有增加,趨于較穩(wěn)定狀態(tài),說明有發(fā)酵中產(chǎn)生的分子量較小的γ-PGA被洗出。對(duì)比透過液(圖7)中各項(xiàng)指標(biāo)檢測,第4次超濾后,洗出的色素、離子和總糖的檢測指標(biāo)變化不大,趨于穩(wěn)定,說明超濾除雜已經(jīng)完成。

圖6 10ku超濾時(shí)超濾次數(shù)對(duì)保留液的影響Fig.6 Effect of ultrafiltrated times on intercepted liquid with 10ku ultrafiltration

圖7 10ku超濾時(shí)超濾次數(shù)對(duì)透過液的影響Fig.7 Effect of ultrafiltrated times on permeabled liquid 10ku ultrafiltration

圖8 30ku超濾時(shí)超濾次數(shù)對(duì)保留液的影響Fig.8 Effect of ultrafiltrated times on intercepted liquid with 30ku ultrafiltration

分析30ku超濾后保留液的檢測結(jié)果(圖8),在第3次超濾后,總糖、色素和電導(dǎo)率趨于0,但γ-PGA仍在下降,說明30ku膜包能洗出較多γ-PGA,損失較大,對(duì)比透過液(圖9),在第4次超濾時(shí),雖然顯示有多糖、離子和色素被洗出,但量都很小,說明用30ku膜超濾,在第3次就已經(jīng)基本完成洗滌,但此時(shí)γ-PGA含量已降到4.5g/L,損失較多,故應(yīng)選用10ku膜進(jìn)行超濾純化,超濾次數(shù)為4次。用10ku循環(huán)超濾濃縮,考察不同濃縮倍數(shù)下滲透通量和γ-PGA得率的變化,確定最終濃縮倍數(shù)(圖10)。

圖9 30ku超濾時(shí)超濾次數(shù)對(duì)透過液的影響Fig.9 Effect of ultrafiltrated times on permeabled liquid 30kDa ultrafiltration

圖10 超濾濃縮倍數(shù)對(duì)滲透通量和得率的影響Fig.10 The influence of ultrafiltration concentration ratio to permeate flux and receiving rate

由圖10可知,隨著濃縮倍數(shù)增加,滲透通量逐漸降低,且降低的幅度逐漸增大,γ-PGA得率隨著濃縮倍數(shù)增高而降低,在第9次后趨于平緩,之后γ-PGA得率隨濃縮倍數(shù)的增加而變化很小,故最終確定將清液濃縮至1/9。

綜上,選擇10ku進(jìn)行超濾,超濾4次后,將清液濃縮至1/9,之后進(jìn)行冷凍干燥18h,得到白色γ-PGA樣品,純度最低為90%,灰分4.3%,蛋白質(zhì)0.01%,總糖含量0.05%,谷氨酸(Glu)含量0%。

3 結(jié)論

γ-PGA發(fā)酵液有一定粘度,稀釋后板框過濾除菌,助濾劑選擇硅藻土和紅土搭配,配比為2∶1,起到助濾除菌的作用,除菌效果與離心相同,除菌率達(dá)97%以上,γ-PGA未降解。發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA時(shí),會(huì)產(chǎn)生多糖,用酶解法去除大分子多糖,在經(jīng)過后續(xù)超濾去除小分子糖,可達(dá)到有效去除多糖的結(jié)果。確定初始的色素濃度對(duì)脫色有一定的意義,實(shí)驗(yàn)證明此方法在脫色上有顯著效果,γ-PGA發(fā)酵液中,色素多為水溶性色素,且大分子量的色素居多,活性炭在吸附色素的同時(shí),對(duì)γ-PGA也有一定的影響,將清液稀釋到OD4400.344后再進(jìn)行脫色,脫色效果明顯提高,且γ-PGA得率較高。采用循環(huán)超濾濃縮的方法去除小分子雜質(zhì)如無機(jī)鹽、小分子色素、谷氨酸和小分子糖等。選擇截留分子量為10ku的膜組件,循環(huán)定容超濾4次除掉小分子雜質(zhì)后,將清液濃縮至1/9。濃縮液真空冷凍干燥,得到白色γ-PGA樣品,純度90%以上,灰分4.3%,蛋白質(zhì)0.01%,總糖含量0.05%,谷氨酸含量0%。

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Study on the separation and purification ofpoly-γ-glutamtic acid without any organic solvents

QIAO Chang-sheng1,2,ZHANG Miao-miao1,LIU Xiao-chen3,GAO Ming-hao1,LIN Hong-xiu1,LOU Peng2

(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University ofScience and Technology,Tianjin 300457,China；2.Tianjin Beiyang Biotrans Co.,Ltd,Tianjin 300457,China；3.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin 300457,China)

For separating γ-PGA without any alcohol,a extractive method was developed to separate and purify γ-PGA from culture broth. The culture broth was filtrated with diatomite to remove cells,and the macromolecular polysaccharide was catabolized by enzymolysis. Then,active carbon was added as decoloring agent and the small molecular weight impurity was removed by ultrafiltration. Finally,purified γ-PGA was obtained by lyophilization. The optimum quantity of using mixed diatomite loading(ratio of coarse to small diatomite 2∶1)was 1.5%(w/v)and over 97% of cells were removed from γ-PGA broth. The optimum conditions of decoloration were as follows:the addition of active carbon 1.5%(w/v),temperature 30℃,pH5,processing time 60min. The optimum membrane module of ultrafiltration was 10ku and the concentration rate of ultrafiltration was 9:1. The purity of γ-PGA was 90% after lyophilization for 18h. The study of separation and purification of poly-γ-glutamtic acid without any organic solvents was imperative and it provided an important basis for Industrial production of γ-PGA.

γ-PGA;remove the bacteria;separation without organic solvents;decoloration;purification

2014-09-02

喬長晟(1969-),男,博士,教授,研究方向:氨基酸及有機(jī)酸發(fā)酵。

TS201.2

B

1002-0306(2015)13-0247-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.044