超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素工藝研究

尹 燕,馮煒弘,楊道蘭,汪建旭,張 艷,王永林

(蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心,甘肅蘭州 730010)

超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素工藝研究

尹 燕,馮煒弘,楊道蘭,汪建旭,張 艷,王永林*

(蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心,甘肅蘭州 730010)

芹菜廢棄莖葉中含有豐富的天然葉綠素,充分利用廢棄資源,對于部分緩解緊缺的天然葉綠素資源及保護環(huán)境具有積極作用。在有機溶劑提取法的基礎(chǔ)上采用單因素實驗及Box- Behnken中心組合設(shè)計對芹菜廢棄莖葉葉綠素超聲波輔助提取工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,用超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素的最佳條件是:液料比20mL/g,提取時間75min,提取溫度50℃。此時樣品葉綠素溶出量預(yù)測值為9.796mg/g,驗證值為9.629mg/g。

芹菜廢棄莖葉,葉綠素,超聲波輔助提取,響應(yīng)面法

芹菜(Apiumgraveolens)屬傘形花科植物,含有類黃酮、葉綠素和膳食纖維等多種生物活性物質(zhì)[1],是一種低熱量、高纖維和高營養(yǎng)價值的食物[2]。近年來,我國芹菜種植面積一直保持在55萬hm2左右,高居世界首位。由于人們長期的飲食習慣,芹菜采收后,在鮮銷和初加工過程中,可食用部分僅為其肉質(zhì)直立的葉柄下半部分,而占整個植株生物量30%左右的葉片及其葉柄上半部分往往作為廢棄物被扔掉,這些廢棄莖葉含水率及有機質(zhì)含量較高,堆放或填埋會產(chǎn)生大量滲濾液,造成嚴重的環(huán)境污染。

葉綠素是一種安全無毒的天然脂溶性色素,廣泛存在于綠色植物中。葉綠素及其衍生物具有抗誘變[3]、抗氧化[4]、預(yù)防癌癥[5]等功能,在醫(yī)藥、食品和日化工業(yè)中用途廣泛[6]。目前葉綠素提取方法主要集中在以下幾種:丙酮研磨法、有機溶劑浸泡法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取和超臨界流動萃取法。國內(nèi)外用于產(chǎn)業(yè)化提取天然葉綠素的原料主要有蠶沙、菠菜、竹葉等。尋求新的葉綠素提取原料,探索高效節(jié)能提取技術(shù),是葉綠素提取、制備領(lǐng)域的發(fā)展方向[7]。

超聲波技術(shù)是利用超聲波在溶劑中產(chǎn)生的振動、空化和攪拌作用破壞組織細胞,使細胞內(nèi)的有效成分迅速溶出[8]。目前超聲波技術(shù)已用于紫丁香葉[9]、蘿卜纓[10]、構(gòu)樹葉[7]等葉綠素的提取,但尚未有芹菜廢棄莖葉葉綠素提取的報道。本研究以芹菜廢棄莖葉為原料,利用超聲波輔助提取,并在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken中心組合設(shè)計優(yōu)化葉綠素的提取工藝,以期為芹菜廢棄莖葉葉綠素的提取及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

芹菜廢棄莖葉 2013年9月對蘭州市榆中縣茂祥蔬菜保鮮庫的新鮮、無腐爛芹菜廢棄莖葉(品種為加州王)進行采樣,50℃左右干燥至恒質(zhì)量,粉碎后過40目篩,密封、避光保存?zhèn)溆?所用試劑均為分析純。

101-3AB恒溫干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;KQ-250TDE 高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司(舒美);UV-2450紫外分光光度計 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素提取方法篩選 有機溶劑乙醇提取法[11]:稱取粉碎40目的芹菜廢棄莖葉5g,用25mL的95%乙醇在60℃恒溫水浴2h,過濾后,濾渣再用25mL 95%乙醇同溫度下提取2h,合并兩次濾液,吸取0.1mL提取液至100mL容量瓶中,用丙酮定容,在645nm和663nm下測定葉綠素吸光度,通過公式計算葉綠素溶出量。

超聲波輔助提取法[12]:稱取粉碎40目的芹菜廢棄莖葉5g,用25mL的95%乙醇在室溫條件下用超聲波處理(功率200W)60min,過濾,吸取0.1mL提取液至100mL容量瓶中,用丙酮定容,在645nm和663nm下測定葉綠素吸光度,通過公式計算葉綠素溶出量。

1.2.2 單因素實驗 根據(jù)1.2.1所得實驗結(jié)果,稱取粉碎40目的芹菜廢棄莖葉5g,采用95%乙醇,在功率200W超聲波條件下處理,分別考察液料比(10、15、20、25、30mL/g)、提取時間(20、40、60、80、100min)、提取溫度(30、40、50、60、70℃)3個因素對芹菜葉綠素溶出量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化芹菜廢棄莖葉葉綠素提取工藝 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken Design的中心組合實驗設(shè)計原理,采用軟件Design-Expert 8.0.5建立三因素三水平的實驗,確定芹菜廢棄莖葉葉綠素提取的最佳工藝條件。以葉綠素溶出量(Y)為考察指標,液料比(A)、提取時間(B)及提取溫度(C)為自變量,因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.4 葉綠素溶出量的測定 將芹菜廢棄莖葉葉綠素溶液稀釋一定倍數(shù),分別于645nm和663nm波長處測定其吸光度值,根據(jù)下面的Arnon修正公式計算葉綠素溶出量[10]。

式中:Y-葉綠素溶出量,mg/g;A645-葉綠素溶液在645nm處測得的吸光度值;A663-葉綠素溶液在663nm處測得的吸光度值;V-溶液體積,mL;W-芹菜廢棄莖葉粉末的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

所有實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)的處理采用Design - Expert 8.0.5 軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜廢棄莖葉葉綠素提取方法確定

由圖1可知,超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素溶出量為乙醇提取的1.99倍。與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比,超聲波產(chǎn)生強烈的振動、空化作用和攪拌作用,不僅大大縮短了提取時間,而且提高了有效成分的得率,這與王豐俊[7]等的研究結(jié)果一致。

圖1 不同提取方法對芹菜廢棄莖葉葉綠素溶出量的影響Fig.1 Effect of extraction methods on the chlorophyll dissolution of discarded stems and leaves of Apium graveolens

2.2 超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素的單因素實驗結(jié)果

2.2.1 液料比對芹菜廢棄莖葉葉綠素溶出量的影響 由圖2可知,隨著液料比的增加,葉綠素溶出量逐漸升高,當液料比增加到20mL/g時,葉綠素溶出量達到最大,這可能是因為隨著液料比增大,物料和溶劑的接觸面積增加,提高了葉綠素的擴散速度,同時液料比增大會降低溶液的黏度,有利于超聲波的攪拌作用,使得葉綠素的溶出量增大[13];液料比繼續(xù)增加時,葉綠素溶出量呈下降趨勢,這可能是因為使用的溶劑增多,超聲波在較多溶劑的體系中,被溶劑介質(zhì)吸收而衰減的能量較多,使提取出來的葉綠素量減少[9]。最終確定的最佳液料比為20mL/g。

圖2 液料比對葉綠素溶出量的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the chlorophyll dissolution

2.2.2 提取時間對芹菜廢棄莖葉葉綠素溶出量的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,葉綠素溶出量不斷增加,當達到80min時,葉綠素溶出量最高,其原因可能是隨著超聲波處理時間的延長,超聲波空化作用增強,使細胞破碎程度增大,加速了細胞內(nèi)葉綠素的溶出;再延長超聲提取時間,葉綠素溶出量反而降低,這可能是由于超聲時間增加,超聲熱效應(yīng)變大,使得熱敏性物質(zhì)葉綠素結(jié)構(gòu)遭到破壞,發(fā)生了一定的降解[14]。最終確定的最佳提取時間為80min。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

圖3 提取時間對葉綠素溶出量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the chlorophyll dissolution

注:* 為5%顯著水平,** 為1%顯著水平。

2.2.3 提取溫度對芹菜廢棄莖葉葉綠素溶出量的影響 由圖4可知,隨著提取溫度的增加,葉綠素溶出量呈先上升后下降的趨勢。40～50℃時,葉綠素溶出量明顯提高,這是由于提高提取溫度,分子的擴散速率增加,葉綠素溶出量增大;當溫度超過50℃時,葉綠素溶出量反而下降,這可能與其葉綠素本身的熱不穩(wěn)定性有關(guān),在60℃以上葉綠素較易被熱分解[7]。最終確定的最佳提取溫度為50℃。

圖4 提取溫度對葉綠素提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the chlorophyll dissolution

2.3 超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素工藝條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以液料比、超聲波提取時間、提取溫度為考察因素,進行三因素三水平中心組合實驗,結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and result of Box-Behnken

利用Design-Expert 8.0.5軟件對所得的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到芹菜廢棄莖葉葉綠素溶出量(Y)對液料比(X1)、提取時間(X2)和提取溫度(X3)的回歸模型方程:

Y=9.75+0.19X1-0.18X2+0.067X3+0.013X1X2-0.230X1X3+0.078X2X3-1.32X12-0.54X22-0.67X32

對上述擬合回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗,結(jié)果見表3和表4。

由表3可以得出,模型p值檢驗表明顯著,失擬項的p>0.05,不顯著,表明擬合程度明顯,模型的預(yù)測值接近實際值,進一步說明該方程是顯著的,此實驗方法可靠。因此,可用該回歸模型進行實驗結(jié)果分析。同時,由于表3中p值小于0.05的對應(yīng)項為模型影響顯著項,因此,本模型中X1、X2、X1X3、X12、X22、X32對結(jié)果影響顯著。對比液料比、提取時間、提取溫度三者的F值也能看出,液料比的影響最大,其次為提取時間,提取溫度影響最小。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 根據(jù)擬合函數(shù),通過Design Expert 8.0.5軟件對各因素之間的交互作用進行響應(yīng)面分析,以葉綠素溶出量為響應(yīng)值的響應(yīng)面圖見圖5～圖7。響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對葉綠素溶出量影響的強弱程度[15],響應(yīng)曲面相對平緩,說明可以容忍處理條件的變異。

圖5 液料比與提取時間對葉綠素溶出量的響應(yīng)面Fig.5 Response surfaces of chlorophyll dissolution under the liquid to solid ratio and extraction time

圖6 液料比與提取溫度對葉綠素溶出量的響應(yīng)面Fig.6 Response surfaces of chlorophyll dissolution under the liquid to solid ratio and extraction temperature

圖7 提取時間與提取溫度對葉綠素溶出量的響應(yīng)面Fig.7 Response surfaces of chlorophyll dissolution under extraction time and temperature

由圖5～圖7等高線圖形可知,存在極值的條件應(yīng)該在圓心處,該模型在實驗范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點,響應(yīng)值存在最大值。由各響應(yīng)面立體圖可看出,料液比響應(yīng)面曲面的坡度較提取時間和提取溫度陡峭,表明液料比主效應(yīng)大于提取時間和提取溫度,與統(tǒng)計結(jié)果相符。

通過軟件分析計算得出芹菜廢棄莖葉葉綠素提取的理論最佳實驗條件是:液料比20.33mL/g,提取時間76.83min,提取溫度50.52℃,在此條件下,葉綠素溶出量的理論值達到9.796mg/g。為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性,采用上述優(yōu)化后的條件進行驗證?？紤]到實際操作的限制,將工藝條件調(diào)整到液料比20mL/g,提取時間75min,提取溫度50℃,通過3次平行實驗,實測葉綠素溶出量為9.629mg/g,與理論值相比,其相對誤差為1.70%。因此,采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準確可靠,具有實用價值。

3 結(jié)論

本文確定了超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素的最佳工藝,建立了超聲波輔助提取芹菜廢棄莖葉葉綠素的二次項數(shù)學模型,通過方差分析,該模型顯著,所得方程擬合度良好,置信度較高。影響芹菜廢棄莖葉葉綠素提取的各因素主次順序為液料比>提取時間>提取溫度,考慮到實際生產(chǎn)的需要,確定其最佳提取工藝條件為:液料比20mL/g,提取時間75min,提取溫度50℃。在此條件下葉綠素實際溶出量為9.629mg/g,與理論值(9.796mg/g)無顯著性差異,說明通過響應(yīng)分析法得到的回歸方程可較好地預(yù)測實驗結(jié)果。本實驗為進一步開發(fā)利用芹菜廢棄莖葉資源提供了科學的理論依據(jù)。

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Technology for extracting chlorophyll from discarded stemsand leaves ofApiumgraveolensby ultrasonic-assisted method

YIN Yan,FENG Wei-hong,YANG Dao-lan,WANG Jian-xu,ZHANG Yan,WANG Yong-lin*

(Agricultural Science and Technology Research Extension Center of Lanzhou,Lanzhou 730010,China)

The discarded stems and leaves ofApiumgraveolensare rich in natural chlorophyll,and extraction of chlorophyll from abundantApiumgraveolensstems and leaves can not only alleviate the shortage of chlorophyll resources but also be beneficial for environmental protection. The chlorophyll was extracted by the method of organic-solution with the ultrasonic-assisted treatment and the Box-Behnken design combined with single factor experiments was used to optimize ultrasonic-assisted extraction of chlorophyll. The results showed that the optimal technological parameters were as follows,liquid to solid ratio of 20mL/g for 75min at 50℃. Under these experimental conditions,the predicted chlorophyll content was 9.796mg/g,the verification extraction yield was 9.629mg/g.

Apiumgraveolenswastes;chlorophyll;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

2014-09-22

尹燕(1983-),女,碩士，助理農(nóng)藝師,研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

*通訊作者:王永林(1969-),男，本科，高級農(nóng)藝師，研究方向：食品加工。

甘肅省科技支撐計劃項目(1304FKCA060);蘭州市科技計劃項目(2012-2-139)。

TS255.36

B

1002-0306(2015)13-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.041