響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取工藝

杜彥影,劉長江,劉旸旸

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取工藝

杜彥影,劉長江*,劉旸旸

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

以軟棗獼猴桃莖為原料,采用乙醇超聲波提取法提取軟棗獼猴桃莖中總生物堿并測定其含量。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間、料液比3個(gè)單因素為自變量,以軟棗獼猴桃總生物堿提取量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。用酸性染料比色法測定軟棗獼猴桃中總生物堿的含量,優(yōu)化出軟棗獼猴桃莖中總生物堿的最佳提取工藝。結(jié)果表明:軟棗獼猴桃莖總生物堿的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、超聲時(shí)間30min、液料比為43倍。在此條件下,用紫外分光光度法測得軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取量為0.542mg/g。

軟棗獼猴桃,總生物堿,響應(yīng)面,提取工藝

為減少因修剪枝條造成的大量損失,從軟棗獼猴桃莖中提取總生物堿是一個(gè)值得研究的課題。近年來,尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)軟棗獼桃莖中生物堿提取工藝的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)首次研究從軟棗獼猴桃莖中提取生物堿。由于生物堿易溶于有機(jī)溶劑,而超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了生物堿等物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解[12-13]。利用乙醇超聲波輔助提取法進(jìn)行軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取,采用酸性染料比色法測定總堿含量[14],并采用響應(yīng)面法對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[15-16],這對軟棗獼猴桃的綜合利用和功能性食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

軟棗獼猴桃莖 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)野生軟棗獼猴桃基地,該品種經(jīng)遼寧省種子管理局鑒定并進(jìn)行新品種備案,命名為長江1號;標(biāo)準(zhǔn)品烏頭堿 中國藥品生物制品鑒定所;無水乙醇、鹽酸、氯仿、氨水、溴麝香草酚藍(lán)、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉 均為分析純。

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;U-2910型紫外可見分光光度計(jì) 日立先端科技股份有限公司;中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;PH計(jì) 德國賽多利斯股份公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 軟棗獼猴桃莖總生物堿的制備 將軟棗獼猴桃莖烘干、粉碎至粉末狀,過60目篩子,準(zhǔn)確稱取軟棗獼猴桃莖粉末5.0g置于燒杯中,加入95%乙醇浸泡24h,在超聲波功率為200W的條件下提取30min,減壓濃縮提取液至浸膏狀,向浸膏中加入2%鹽酸20mL酸化,靜置,過濾,濾渣用2%的10mL鹽酸清洗兩次,濾液用30mL氯仿萃取3次,去除雜質(zhì),向?yàn)V液中加入濃氨水調(diào)節(jié)pH至10左右,再用等體積氯仿萃取3次,合并濾液,濃縮,用氯仿定容至25mL容量瓶中備用。

基于以上分析，未來我國智能電網(wǎng)的建設(shè)應(yīng)從電源側(cè)、電網(wǎng)側(cè)、配用電側(cè)和調(diào)度控制的智能化四個(gè)層面開展，如圖3所示。

1.2.2 最大吸收波長的確定 采用酸性染料比色法,精密吸取樣品溶液1mL,將其置于分液漏斗中,加入溴麝香草酚藍(lán)緩沖液6mL,再加入氯仿6mL,充分振搖1min,靜置30min,使氯仿和樣品溶液充分分層,分取氯仿層,用脫脂棉除去水分,在200～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描[18]。取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL,方法同上進(jìn)行測定;另取氯仿1mL,同法操作,所得氯仿溶液為空白溶液。結(jié)果表明,烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液和生物堿樣品溶液的最大吸收峰均出現(xiàn)在415nm處,本實(shí)驗(yàn)選取415nm為最大吸收波長。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制:精密稱量烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品3.5mg,置于50mL容量瓶中,用氯仿溶解并定容至刻度,即得質(zhì)量濃度為0.07mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精密吸取配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL,按1.2.2所述顯色后,以1號為空白溶液,用紫外分光光度計(jì)分別在415nm處測定吸光度,縱坐標(biāo)為吸光度(Y)、橫坐標(biāo)為烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X/(mg/mL)),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=5.7436x+0.0255,R2=0.9996。

1.2.4 軟棗獼猴桃莖總生物堿的測定 精密吸取制備好的生物堿樣品溶液1mL,測定吸光度,重復(fù)進(jìn)行3次,取其平均值為吸光度。通過測得的吸光度,計(jì)算出對應(yīng)的質(zhì)量濃度,軟棗獼猴桃莖總生物堿的計(jì)算公式為:

軟棗獼猴桃莖總生物堿的提取量(mg/g)=C×V/M

方程式中:C為軟棗獼猴桃莖總生物堿提取液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為提取液定容的體積(mL);M為軟棗獼猴桃粉末樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取軟棗獼猴桃莖粉末5g分別加入無水乙醇200mL浸泡,超聲波提取30min,以總生物堿提取量為考察指標(biāo)評價(jià)提取效果,分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對總生物堿提取量的影響[19]。重復(fù)單因素實(shí)驗(yàn)3次,利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 根據(jù)BOX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[20],選取對軟棗獼猴桃莖中總生物堿提取率有顯著影響的單因素乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間、料液比為自變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),考察提取總生物堿的最佳工藝條件。表1為實(shí)驗(yàn)因素水平編碼。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of response surface test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對總生物堿提取量的影響如圖1。由圖可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),生物堿的提取效果最好,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～80%范圍內(nèi),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,提取效果不斷提高,而在超過80%后提取效果反而隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而降低,原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過大,軟棗獼猴桃莖中其他有效成分溶解在提取液中,影響生物堿的提取效果。故選乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總生物堿提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on total alkaloids yield

2.1.2 超聲波時(shí)間的影響 不同的超聲波時(shí)間對總生物堿提取量的影響如圖2。由圖可知,在超聲波時(shí)間為30min時(shí),生物堿的提取效果最好,在30min之前,提取效果隨超聲時(shí)間呈上升趨勢,但隨著時(shí)間的延長,軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取效果明顯下降,可能是因?yàn)樯飰A在超聲波的空化作用下,使生物堿的結(jié)構(gòu)被破壞,從而導(dǎo)致生物堿的提取效果下降。故選超聲時(shí)間為30min。

圖2 超聲波時(shí)間對總生物堿提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on total alkaloids yield

2.1.3 液料比的影響 不同的液料比對總生物堿提取量的影響如圖3。由圖可知,隨著溶劑量的不斷增加,生物堿的提取效果呈顯著增長的趨勢,這可能是因?yàn)槿軇┡c浸提物接觸充分,使溶出率增加,當(dāng)液料比達(dá)到40倍時(shí),生物堿的提取效果最好,隨著溶劑量的繼續(xù)增加,提取量略有下降,這可能是因?yàn)檐洍棲J猴桃莖中總生物堿的溶出已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。為減少實(shí)驗(yàn)成本,故選擇液料比為40倍。

圖3 料液比對總生物堿提取量的影響Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on total alkaloids yield

2.1.4 提取次數(shù)的影響 不同的提取次數(shù)對總生物堿提取量的影響如圖4。由圖可知,隨著提取次數(shù)的增加,總生物堿提取量的變化并不明顯。為了降低實(shí)驗(yàn)成本和節(jié)約時(shí)間,故選提取次數(shù)為2次。

圖4 提取次數(shù)對總生物堿提取量的影響Fig.4 Effects of extract times on total alkaloids yield

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。根據(jù)響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計(jì),共對17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取量見表2。

利用Design-Expert.8.05b軟件進(jìn)行分析,以軟棗獼猴桃總生物堿的提取量為響應(yīng)值,得到軟棗獼猴桃莖中總生物堿的提取量(Y)對乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲波時(shí)間(B)、液料比(C)的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為:Y=0.54-0.030A-0.025B+0.025C-2.500E-003AB-0.043AC+0.052BC-0.056A2-0.061B2-0.056C2。模型系數(shù)顯著性結(jié)果和方差分析結(jié)果見表3。

表2 軟棗獼猴桃莖總生物堿響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test design and results of response surface analysis of Actinidia arguta stems

由表3知,乙醇體積分?jǐn)?shù)一次項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互項(xiàng)、超聲波時(shí)間與液料比的交互項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)、超聲波時(shí)間的二次項(xiàng)和液料比的二次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平(p<0.0001)。超聲波時(shí)間的一次項(xiàng)和液料比的一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平(p<0.05)。乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲波時(shí)間的交互項(xiàng)不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明,各變量因素對總生物堿提取效果的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用軟件Design-Expert 8.05b對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸多元擬合,得到的二次回歸方程的響應(yīng)面,見圖5～圖7。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析表Table 3 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

注:**：差異極顯著,p<0.0001;*：差異顯著,p<0.05。

由圖5可知,響應(yīng)面圖形表示了乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)與超聲波時(shí)間(B)交互作用的3D圖,從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看到,在所選范圍內(nèi)存在最大值。響應(yīng)面的等高線可以看出各因素對響應(yīng)值的影響程度,響應(yīng)面曲面坡度的陡峭度可以看出各因素交互作用的強(qiáng)弱。當(dāng)液料比固定在43倍時(shí),當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%左右時(shí),超聲波時(shí)間為30min附近時(shí),總生物堿提取量達(dá)到最大值。由響應(yīng)面圖形可以觀察到,等高線的形狀偏圓形,表明乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和超聲波時(shí)間(B)交互作用不顯著。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲波時(shí)間對總生物堿提取量的影響Fig.5 Effect of volume fraction of ethanol and ultrasonic time on extract yield of total alkaloids

由圖6可知,響應(yīng)面圖形表示了乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)與液料比(C)交互作用的3D圖。當(dāng)超聲波時(shí)間固定在30min時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%,料液比在40倍時(shí),總生物堿的提取效果最佳。由響應(yīng)面圖形可以觀察到,等高線的形狀偏橢圓形,表明乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和超聲波時(shí)間(C)交互作用顯著。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對總生物堿提取量影響Fig.6 Effect of volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio on extract yield of total alkaloids

由圖7可知,響應(yīng)面圖形表示了乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)與液料比(C)交互作用的3D圖。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定在72%時(shí),當(dāng)超聲波時(shí)間短,液料比低時(shí),總生物堿提取效果不好,隨著超聲時(shí)間的增加和液料比的增大,總生物堿的提取效果增大,當(dāng)超聲波時(shí)間為30min,液料比為43倍時(shí),總生物堿的提取率達(dá)到最高。由響應(yīng)面圖形可以觀察到,等高線呈橢圓形,超聲波時(shí)間和液料比的相互作用顯著。

圖7 超聲時(shí)間與液料比對總生物堿提取量影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on extract yield of total alkaloids

利用Design-Expert8.05b軟件分析可知,得到軟棗獼猴桃莖總生物堿的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為72.03%,超聲波時(shí)間為29.32min,液料比為43.43倍。在此條件下,得到軟棗獼猴桃總生物堿提取量的理想值為0.550939mg/g。為了方便實(shí)驗(yàn)操作,我們選擇的實(shí)驗(yàn)條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%,超聲波時(shí)間為30min,液料比為43倍,得到的總生物堿提取量的實(shí)際值為0.542mg/g。這與理論值十分相近,因此,可以采用響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴莖總生物堿的提取工藝。

3 結(jié)論

在軟棗獼猴桃莖總生物堿提取的工藝中,乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間和液料比對總生物堿提取量都有一定的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析法,以總生物堿提取量為指標(biāo),確定了最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%、超聲時(shí)間為30min和液料比為43倍,在此條件下測得軟棗獼猴桃總生物堿的實(shí)際值為0.542mg/g。

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Optimization of total alkaloids extraction fromActinidiaargutastems using response surface methodology

DU Yan-ying,LIU Chang-jiang*,LIU Yang-yang

(College Food Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

The total alkaloids fromActinidiaargutastems were extracted and measured using the method of ultrasonic extraction with ethanol as extraction solvent. Response surface methodology was taken to optimize the extraction of total alkaloids inActinidiaargutastems. Three elements including ethanol concentration,ultrasonic time and solid-liquid ratio were selected to maximize the yield of total alkaloids. Furthermore,the optimal extraction conditions of total alkaloids fromActinidiaargutastems were 72% ethanol,ultrasonic treatment time 30min,liquid-solid ratio 43. Under these conditions,the content of total alkaloids was 0.542mg/g fromActinidiaargutastems by ultraviolet spectrophotometer.

Actinidiaargutastem;total alkaloids;response surface methodology;extraction

2014-09-22

杜彥影(1989-),女,碩士,研究方向:食品生物技術(shù)。

*通訊作者:劉長江(1955-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術(shù)。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903013)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)13-0220-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.038