β環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變基因的表達(dá)及突變酶酶學(xué)性質(zhì)分析

王 華,李 華

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

王 華,李 華*

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

通過對(duì)已構(gòu)建的β-CGTase質(zhì)粒載體采用一步PCR法進(jìn)行大片段基因的定點(diǎn)突變,得到三個(gè)帶有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒載體,并將其進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到突變菌株。分析突變酶的酶學(xué)性質(zhì)并與β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶比較,結(jié)果表明突變酶酶活力提高到原酶活力的1.6倍以上,且突變酶作用的最適溫度60℃、最適pH6.0、在60℃下和pH5～8范圍內(nèi)均非常穩(wěn)定,經(jīng)方差分析突變酶與原酶的酶學(xué)性質(zhì)差異不顯著(p>0.05),但是酶活力差異顯著(p<0.05)。

β-環(huán)糊精葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶,定點(diǎn)突變,環(huán)化活性,溫度,pH

β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β-CGTase)屬于α-淀粉酶家族,可以作用于淀粉的葡萄糖單位通過α-1,4-糖苷鍵連接而生成β-環(huán)糊精(β-CD)。β-CD的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有非極性空穴和外親水的特點(diǎn),常被用作分子膠囊和乳化劑,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)藥等領(lǐng)域[1-2]。β-CGTase是催化淀粉發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成β-CD的關(guān)鍵酶。

天然的β-CGTase主要來源于芽孢桿菌(Bacillaceae)[3],由于其發(fā)酵分泌產(chǎn)生的β-CGTase的產(chǎn)量較低從而使得酶法生物轉(zhuǎn)化β-CD效率低[4]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展β-CGTase已被分離純化,相應(yīng)的酶的編碼基因(cgt基因)也得到了克隆表達(dá)[5]。關(guān)于β-CGTase基因研究已有很多報(bào)道,基因序列中含有一個(gè)780bp的開放閱讀框,由259個(gè)氨基酸組成的多肽鏈,分子量在70ku左右[6]。與此同時(shí),基因工程定點(diǎn)突變技術(shù)廣泛應(yīng)用于酶的體外改造中,通過改變酶的基因序列來改變酶與底物的結(jié)合能力,從而改變酶的活性。Shin Hyun-Dong等[7]人利用定點(diǎn)突變技術(shù)將β-CGTase基因中W652突變成G,結(jié)果表明酶的環(huán)化活性增強(qiáng)而水解及偶合活性降低。通過對(duì)來自B,circulans 251中的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行突變Ala230Val,使該酶的水解活性提高而環(huán)化活性降低[8]。因此,通過增強(qiáng)酶與底物的結(jié)合能力來提高酶法生物轉(zhuǎn)化β-CD效率成為目前研究的熱點(diǎn)。

表1 PCR定點(diǎn)突變所用引物Table 1 Primer pairs with PCR site-directed mutagenesis

本實(shí)驗(yàn)是在根據(jù)β-CGTase基因序列的晶體結(jié)構(gòu),在SWISS-MODEL上建模,分析得到β-CGTase保守區(qū)內(nèi)影響到酶環(huán)化活性的幾個(gè)突變位點(diǎn)Y127,R254,D355,一步PCR法進(jìn)行大片段基因的定點(diǎn)突變,并在大腸桿菌中得到異源表達(dá),對(duì)突變酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析,為酶法生物轉(zhuǎn)化β-CD效率的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株EscherichiacoliBL21(DE3) 上海光明乳業(yè)有限公司技術(shù)中心惠贈(zèng),重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28b::CGTase為上述技術(shù)中心構(gòu)建。La Taq聚合酶/限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoⅠ以及分子量標(biāo)準(zhǔn)250 bp DNA Ladder Marker、DL10000 DNA Marker 均購自TaKaRa公司。

硫酸卡那霉素,Triton X-100,甘氨酸,可溶性淀粉 均購于北京鼎國;常規(guī)化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉10g,玉米漿20g,淀粉10g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O 0.2g,調(diào)pH8.0。另配20% Na2CO3單獨(dú)滅菌,接種時(shí)每100mL培養(yǎng)基中加入2mL。

ABI PCR擴(kuò)增儀 Applied Biosystems;凝膠成像系統(tǒng) DNr MiniBis pro。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變酶表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)β-CGTase基因序列的晶體結(jié)構(gòu),在SWISS-MODEL上建模,通過對(duì)β-CGTase基因和3個(gè)突變氨基酸相應(yīng)位點(diǎn)及其兩側(cè)的堿基序列進(jìn)行分析,使用軟件Primer premier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)β-CGTase的引物和3對(duì)突變引物(見表1)。

以質(zhì)粒pET-28b::CGTase為模板,以突變引物為引物,體系中加入La Taq 聚合酶,設(shè)定擴(kuò)增各個(gè)帶有突變基因的質(zhì)粒程序:94℃,90s;98℃,10s:68℃,10min,30個(gè)循環(huán);72℃,10min;4℃保溫[9-11]。PCR擴(kuò)增后,利用熱擊法將克隆載體轉(zhuǎn)化到E.coliBL(21)中,在含有100mg/mL卡那霉素的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白色單菌落進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng),經(jīng)過菌液PCR檢測及質(zhì)粒雙酶切鑒定片段大小正確后,將陽性菌株送上海生工進(jìn)行基因測序。

1.2.2 粗酶液的制備 分別將測序正確的突變菌株接種于含有10μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,37℃過夜震蕩培養(yǎng);取上述菌液按1∶30的比例接種于新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基(含有10μg/mL硫酸卡那霉素)中,37℃振蕩培養(yǎng)8h,然后加入1%乳糖過夜誘導(dǎo)表達(dá),再加入終濃度分別為0.5%和1%的Triton X-100和甘氨酸繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8h后,7000r/min、4℃離心10min,上清即為粗酶液。

1.2.3 突變酶的酶活分析——藍(lán)值法 取0.01mL適當(dāng)稀釋的粗酶液,加0.2mL pH9.0 Gly-NaOH緩沖溶液,再加入現(xiàn)配現(xiàn)用的0.2%馬鈴薯淀粉溶液0.2mL,40℃反應(yīng)10min,立即加入0.5mL 0.5mol/L冰醋酸終止反應(yīng),加入3mL 0.005%碘溶液顯色,以不加酶液溶液的反應(yīng)液作空白對(duì)照,在700nm測定吸光度OD值。將一個(gè)酶活力單位定義為藍(lán)值下降10%所需的酶量[12]。

注:式中a為對(duì)照組OD值,b為樣品OD值

1.2.4 pH對(duì)酶活及酶穩(wěn)定性的影響 將酶在pH4.0～11.0的不同緩沖液中按方法1.2.2測定其對(duì)應(yīng)的酶活力。調(diào)節(jié)pH的緩沖液:乙酸-乙酸鈉緩沖液pH4.0～5.0,Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH6.0～8.0,甘氨酸-NaOH緩沖液pH9.0～11.0。

將酶在pH4.0～11.0的不同緩沖液中室溫下放置1h后,按方法1.2.3測定各突變體表達(dá)酶的活力[12]。以在最適反應(yīng)pH下所測得的酶活力為100%。

1.2.5 溫度對(duì)酶活及酶穩(wěn)定性的影響 將酶液分別在30～80℃下按方法1.2.3測定酶液的活力。

在pH6.0的磷酸鹽緩沖液中,將酶液在不同溫度下保溫1h后,按上述方法測定相對(duì)酶活[13]。以在最適反應(yīng)溫度下保溫所測得的酶活力為100%。

1.2.6 突變酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定 取100μL經(jīng)過純化的突變酶(質(zhì)量約為0.5μg),加入200μL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0),再分別加入0.4～6.0mg/mL玉米淀粉溶液,60℃反應(yīng)10min后測定其酶活力[14-15]。用Linewear-Burk 作圖法得出突變酶對(duì)底物淀粉的Km、Vmax、kcat和kcat/Km的數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-CGTase突變表達(dá)載體的構(gòu)建

以F、R為引物,以陽性克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,在大約2.1kb處有一條很亮的擴(kuò)增條帶,如圖1。以質(zhì)粒pET-28b::CGTase為對(duì)照,對(duì)三個(gè)突變表達(dá)載體Y127F、R254F、D355R經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,突變體在2139bp和5368bp處有特異性條帶,如圖2所示。將酶切與PCR鑒定正確的突變質(zhì)粒菌株送往上海生工進(jìn)行核苷酸序列測定,測序引物為通用引物:T7。測序結(jié)果經(jīng)DNAMANDNAMAN-Align比對(duì),證實(shí)了相應(yīng)的氨基酸序列也得到了預(yù)期突變,分析結(jié)果見圖3。圖中灰色部位即為突變位點(diǎn)的氨基酸位點(diǎn)。

圖1 不同突變體的突變基因片段擴(kuò)增電泳分析Fig.1 Electrophoresis of the amplified fragment of different mutants注:M:250bp Marker(250,500,750,1000,1500,2250,3500,4500bp);1:pET-28b::CGTase;2:Y127F;3:R254F;4:D355R。

圖2 突變質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of mutation by restriction enzymes注:M:DL10000 Marker(250,500,1000,2000,4000,7000,10000bp);1:pET-28b::CGTase質(zhì)粒;2:pET-28b::CGTase質(zhì)粒酶切;3:Y127F質(zhì)粒;4:Y127F質(zhì)粒酶切;5:R254F質(zhì)粒;6:R254F質(zhì)粒酶切;7:D355R質(zhì)粒;8:D355R質(zhì)粒雙酶切。

圖3 β-CGTase基因序列與突變基因序列多重序列比較Fig.3 Multiple alignment of the amino-acid sequences of β-CGTase and mutants

2.2 pH對(duì)酶活及其穩(wěn)定性的影響

如圖4a所示,不同pH反應(yīng)下出發(fā)菌株pET-28b::CGTase及突變菌株p-YF、p-RF和p-DR的粗酶液的β- CGTase的活力。由圖可見,隨著pH的升高,酶活力逐漸增大,在弱酸(pH6.0)條件下各菌株的酶活力均達(dá)到最大酶活,當(dāng)繼續(xù)增大pH活力反而降低,因此確定突變菌株與出發(fā)菌株的β- CGTase的最適反應(yīng)pH一致,即酶的最適反應(yīng)pH是6.0。

圖4 pH對(duì)β-CGTase活力及其穩(wěn)定性的影響 Fig.4 pH-activity profiles and stability of β-CGTase 注:圖a為pH對(duì)β-CGTase活力的影響;圖b為pH對(duì)β-CGTase穩(wěn)定性的影響。

將酶液與不同pH的緩沖溶液混合室溫下放置1h,在60℃下測定出發(fā)菌株與突變菌株產(chǎn)β-CGTase的酶活力,如圖4b所示,β-CGTase在pH5.0～8.0較廣pH范圍內(nèi)均較穩(wěn)定,酶活力都在90%以上,這一性質(zhì)與出發(fā)菌株保持一致,經(jīng)方差分析,pH對(duì)各酶穩(wěn)定性影響差異不顯著(p>0.05)。

2.3 溫度對(duì)酶活及其穩(wěn)定性的影響

不同反應(yīng)溫度下出發(fā)菌株pET-28b::CGTase及突變菌株p-YF、p-HC、p-RF和p-DR的粗酶液的β-CGTase的活力如圖5a。由圖可見,隨著反應(yīng)溫度的升高,酶活力逐漸增大,當(dāng)溫度在60℃各菌株的酶活力均達(dá)到最大酶活,當(dāng)繼續(xù)升高溫度酶活反而降低,因此確定突變菌株與未突變的菌株的β-CGTase的最適反應(yīng)溫度一致,即酶的最適反應(yīng)溫度為60℃。

將酶液在不同溫度下保溫1h后,在60℃下測定出發(fā)菌株與突變菌株產(chǎn)β-CGTase的酶活力,如圖5b所示,β-CGTase在60℃下保溫1h后酶活力仍然保持在90%以上,超過60℃酶活力逐漸降低。表明突變菌株p-YF、p-HC、p-RF和p-DR在60℃下具有一定的耐熱性,這一耐熱性與出發(fā)菌株保持一致。經(jīng)方差分析,溫度對(duì)各酶穩(wěn)定性影響差異不顯著(p>0.05)。

表2 pET-28b::CGTase和突變菌株p-YF、p-RF和p-DR的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of β-CGTase and mutants

圖5 溫度對(duì)β-CGTase活力及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Temperature-activity profiles and stability of β-CGTase 注:圖a為溫度對(duì)β-CGTase活力的影響; 圖b為溫度對(duì)β-CGTase穩(wěn)定性的影響。

注:*差異顯著(p<0.05);a表示各突變酶與pET-28b::CGTase相對(duì)酶活的比值。

2.4 β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以玉米淀粉濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo),作雙倒數(shù)曲線為,如圖6所示。其中x為底物玉米淀粉濃度的倒數(shù),y為反應(yīng)速度的倒數(shù)。根據(jù) Linewear-Burk 雙倒數(shù)作圖法求得酶以玉米淀粉為底物時(shí)的Km為和Vmax,結(jié)果見表2。

圖6 β-CGTase的雙倒數(shù)曲線Fig.6 Lineweaver-burk plot of β-CGTase

由圖6和表2的結(jié)果可以得出,與出發(fā)菌株相比突變菌株產(chǎn)β-CGTase的Km值較低,其Vmax稍有提高。根據(jù)催化效率可以簡單的解釋這個(gè)變化。

催化效率=Kcat/Km

kcat-酶的轉(zhuǎn)換數(shù),是指酶被底物飽和時(shí),單位時(shí)間(/S)內(nèi)單個(gè)酶分子與底物作用并轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。kcat等于Vmax與酶的總濃度的比值。

由表2可知,突變酶與原酶的Vmax相差非常小,因此它們的kcat相差也非常小,所以由上式可知突變酶較小的Km值應(yīng)該具有較大的催化效率。同時(shí),Km值的大小就可以表示酶與底物之間親和力的強(qiáng)弱,Km值越小親和力越強(qiáng)。由此可知,經(jīng)過突變后得到的菌株分泌產(chǎn)生的β-CGTase與底物玉米淀粉的親和性提高,這個(gè)結(jié)論與藍(lán)值法檢測酶活力的結(jié)果是一致的(表2),即突變酶活力與原酶活力差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)表明,通過對(duì)β-CGTase突變基因的表達(dá)并對(duì)各突變菌株的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析,證實(shí)了突變菌株p-YF、p-RF和p-DR分泌產(chǎn)生的β-CGTase反應(yīng)的最適溫度為60℃、最適pH為6.0,與原酶保持一致。且通過方差分析得知,溫度、pH對(duì)突變酶與原酶的穩(wěn)定性的影響差異不顯著(p>0.05)。

通過實(shí)驗(yàn)得知,突變酶的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值發(fā)生了改變,與原酶相比突變酶的Km值均減小,而這說明定點(diǎn)突變沒有改變酶的催化特征,而是提高了酶與底物淀粉的親和力從而提高了(-CGTase突變酶環(huán)化活力。這個(gè)結(jié)論與藍(lán)值法檢測酶活力的結(jié)果是一致的,突變酶的環(huán)化活力提高至原酶環(huán)化活力的1.6倍以上,其中突變酶Y127F的活力約達(dá)到原酶活力的2.1倍。經(jīng)方差分析,突變酶環(huán)化活力與原酶環(huán)化活力差異顯著(p<0.05)。因此,可以推斷突變酶環(huán)化活力的提高是由于酶與底物玉米淀粉的親和力的提高所引發(fā)的。

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Study on mutant gene expression of β-CGTaseand its enzymology characteristics analysis

WANG Hua,LI Hua*

(College of Life Science,Inner Mongolia University for Nationnalities,Tongliao 028000,China)

Using one-step PCR,three amino acid residues Y127,R254 and D355 within the conserved protein domain of β-cyclodextrin glucosyl transferase were subjected to site-directed mutagenesis,and the mutant plasmids were transformed intoEscherichiacoliBL21(DE3)for effective expression,respectively. The result showed that the activity of mutant enzymes was 1.6 times higher than initial enzyme. The mutant enzymes were optimal at 60℃ and pH6.0,and that the enzymes were stable for at least 60min at 60℃ and across a wide pH5.0～8.0,the enzymatic properties existed no significant difference among mutant enzymes and initial enzyme(p>0.05),but there existed significant difference about activity between mutant enzymes and initial enzyme(p<0.05).

β-cyclodextrin glucosyl transferase;site-directed mutagenesis;cyclization activity;temperature;pH

2014-09-17

王華(1981-),女,博士,副教授,主要從事功能性食品與生物反應(yīng)器的研究。

*通訊作者:李華(1967-),女,學(xué)士,教授,主要從事食品營養(yǎng)的研究。

內(nèi)蒙古民族大學(xué)國培項(xiàng)目(NMDGP1413)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)13-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.029