酶法結(jié)合超聲波提取粉葛葛根素的研究

李甜甜,傅 舒,劉曉風(fēng),李 東,王舒雅,鄭 濤,*

(1.南京工業(yè)大學(xué),江蘇南京 211816;2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,四川成都 610041;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

酶法結(jié)合超聲波提取粉葛葛根素的研究

李甜甜1,傅 舒2,3,劉曉風(fēng)2,李 東2,王舒雅1,鄭 濤1,*

(1.南京工業(yè)大學(xué),江蘇南京 211816;2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,四川成都 610041;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

目的:以提高粉葛葛根素的得率為目的。方法:在優(yōu)選出纖維素酶結(jié)合超聲波的方法基礎(chǔ)上,采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法,對(duì)影響酶解反應(yīng)的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果:最佳酶解反應(yīng)條件為固液比1∶31(g/mL)、酶解時(shí)間9.8h、酶添加量31.84U/g,超聲條件為功率150W、頻率40kHz、時(shí)間30min。在此條件下得率為0.728%,比優(yōu)化前提高15.37%,比單純超聲波提取法和傳統(tǒng)乙醇浸提法分別高出24.7%和28.0%。結(jié)論:初步建立了纖維素酶結(jié)合超聲波技術(shù)提取粉葛葛根素的最優(yōu)工藝條件。

纖維素酶,粉葛,葛根素,因素,響應(yīng)面分析

葛素有“北參南葛”、“亞洲人參”之美稱(chēng),是國(guó)家衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食同源藥食兩用植物[1-2]。葛根為豆科多年生落葉藤本植物甘葛藤(P.thomsoniBenth)的干燥根,富含葛根淀粉和葛根黃酮(含量約為1%～12%)。其中葛根黃酮的主要成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元等,具有抗癌、抗衰老、降低膽固醇、治療心腦血管疾病、解酒等功效[3-5],因此,對(duì)葛根有效成分的提取方法的研究對(duì)開(kāi)發(fā)該植物資源具有重要意義。

目前,葛根素的提取分離方法有回流法、滲漉法、浸漬法、煎煮法等[6-7],但存在原料消耗大、產(chǎn)率低、提取時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題[8]。近年來(lái),酶技術(shù)作為新的強(qiáng)化提取技術(shù)發(fā)展迅速,具有傳質(zhì)速率高,能耗低、有機(jī)溶劑用量少、提取物穩(wěn)定等特點(diǎn)。纖維素酶可降解β-1,4糖苷鍵從而破壞植物細(xì)胞壁,加速有效成分的溶出,提高有效成分的提取率[9-10]。邢秀芳等[11]將纖維素酶用于葛根異黃酮的提取工藝中,通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)加酶處理得到的樣品比未加酶的葛根異黃酮的收率提高了13%。超聲提取法是近年來(lái)較新型的提取方法,超聲空化作用有助于破壞細(xì)胞膜,促進(jìn)物質(zhì)釋放與溶出,且超聲波的不斷振蕩和熱效應(yīng)有助于溶質(zhì)擴(kuò)散,具有效率高、提取時(shí)間短、能耗低、節(jié)約溶劑等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于化合物及生物活性成分等物質(zhì)的提取[12-13]。

酶法結(jié)合超聲波技術(shù)用于天然產(chǎn)物活性成分的提取,已有相關(guān)報(bào)道,例如靈芝多糖、山楂總黃酮等[14-15],但將該技術(shù)用于提取葛根中有效成分至今未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本文對(duì)酶解提取葛根素的主要影響因素進(jìn)行研究,并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法得出了纖維素酶結(jié)合超聲波技術(shù)提取粉葛葛根素的最優(yōu)工藝條件,為葛根素的工業(yè)化提取和相關(guān)功能性食品或藥物的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根 粉葛,采集于江西省上饒橫峰葛源鎮(zhèn)。將采集樣品洗凈,去除表面泥沙,晾干、切成片狀,于60℃烘干、粉碎,過(guò)60～80目篩后于干燥器中保存?zhèn)溆?葛根素對(duì)照品(純度≥98%) 國(guó)藥品生物制品檢定所;纖維素酶Celluclast 1.5L(反應(yīng)最適溫度45℃,濾紙酶活(自測(cè))為31.84U/mL) 諾維信公司。

HITACHI L2000高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;KQ3200DE型數(shù)控超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;FA2004N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根素提取

1.2.1.1 乙醇浸提法 準(zhǔn)確稱(chēng)取若干份粉葛樣品1.000g于100mL錐形瓶中,加入70%乙醇,使固液比為1∶20,提取溫度70℃,浸提2h。結(jié)束后離心得上清液并量取體積。

1.2.1.2 超聲提取法 準(zhǔn)確稱(chēng)取若干份粉葛樣品1.000g于100mL錐形瓶中,加入70%乙醇,使固液比為1∶20,提取溫度60℃,提取30min。用功率為150W、頻率為40kHz的超聲波器提取。結(jié)束離心得上清液并量取體積。

1.2.1.3 纖維素酶結(jié)合超聲波提取法 準(zhǔn)確稱(chēng)取若干份葛根樣品1.000g于100mL錐形瓶中,45℃自然pH下酶解一定時(shí)間,酶解結(jié)束后離心收集上清液Ⅰ。固體殘?jiān)?.3.2超聲提取條件進(jìn)行提取,然后離心得上清液Ⅱ。合并上清液Ⅱ和Ⅰ所得待測(cè)液并量取體積。

1.2.2 葛根素得率的測(cè)定 將以上三種方法所得待測(cè)液過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后,采用HPLC法測(cè)定葛根素濃度,并計(jì)算得率。HPLC條件是:流動(dòng)相為甲醇∶水25∶75,流速1.0mL/min,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm,進(jìn)樣量5μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定:稱(chēng)取葛根素標(biāo)準(zhǔn)樣品,用甲醇配制成0.5mg/mL的溶液,作為對(duì)照品溶液。按照一定梯度精密稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積為Y值,葛根素(mg/mL)為X值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:Y=9×10-7X+32183,R2=0.9999。待測(cè)液的測(cè)定:分別取所得的待測(cè)液,供HPLC測(cè)定分析。根據(jù)峰面積計(jì)算上清液中葛根素的得率。

式中:濃度c(mg/mL);v為上清液體積(mL);n為:稀釋倍數(shù);m為粉葛重量(mg)。

1.2.3 纖維素酶結(jié)合超聲波提取葛根素的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響 加入70%乙醇溶液15mL,酶添加量為0.2mL/g,分別酶解2、4、6、8、10、12、13h,反應(yīng)結(jié)束后處理方法同1.2.1.3。

1.2.3.2 酶解固液比對(duì)葛根素得率的影響 酶添加量為0.2mL/g,加入70%乙醇溶液,使固液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL),酶解2h,反應(yīng)結(jié)束后處理方法同1.2.1.3。

1.2.3.3 酶添加量對(duì)葛根素得率的影響 加入70%乙醇溶液20mL,酶解時(shí)間2h,酶添加量分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5(mL/g),反應(yīng)結(jié)束后處理方法同1.2.1.3。

1.2.4 纖維素酶結(jié)合超聲波提取粉葛葛根素的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[16-17]。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì),各因素的低、中、高水平分別以(-1,0,1)表示,見(jiàn)表1。獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后,進(jìn)行二次回歸擬合,得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次方程,分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng),最后在一定水平范圍內(nèi)確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件,并進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 Factors and levers of response surface Box-Benhnkens design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法的葛根素得率

不同處理方法的葛根素得率見(jiàn)表2,用超聲波提取法所得的葛根素的得率比乙醇浸提法所得的葛根素的得率只提高了2.6%,但是提取時(shí)間大大縮短。粉葛經(jīng)酶解后采用超聲輔助提取法所得葛根素的得率比乙醇浸提法和超聲波提取法分別提高了10.9%和8.05%。為了進(jìn)一步提高粉葛中葛根素的得率,以下采用酶解與超聲波輔助提取相結(jié)合的方法提取粉葛葛根素,并對(duì)酶解的主要影響因素進(jìn)行研究。

表2 不同提取方法的葛根素得率Table 2 Yield of puerarin with different approach method

2.2 纖維素酶結(jié)合超聲波提取葛根素的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響 酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著酶解時(shí)間的增加,葛根素得率也隨之增加。增加酶解時(shí)間能使原料中物質(zhì)溶解的更加充分,當(dāng)酶解時(shí)間為10h時(shí)葛根素得率到達(dá)到最大值,繼續(xù)增加酶解時(shí)間反而使葛根素得率下降,這可能是黃酮類(lèi)物質(zhì)本身易被氧化,過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)破壞其結(jié)構(gòu),從而降低葛根素得率[18],且提取時(shí)間越長(zhǎng)能耗及其它經(jīng)濟(jì)成本越大,故10h為較合適的酶解時(shí)間。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響Fig.1 Effect of enzymatic time on yield of puerarin

2.2.2 酶解固液比對(duì)葛根素得率的影響 根據(jù)傳質(zhì)速率方程[19],溶劑的質(zhì)量體積比即固液比是影響提取速率和提取得率的主要因素之一,酶解固液比對(duì)葛根素得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著固液比的增加,葛根素得率也隨之增加,固液比為1∶30(g/mL)時(shí)葛根素得率達(dá)到最高值0.662%。這是因?yàn)殡S著溶劑量的增大,溶劑和葛根粉末之間的接觸面積變大,增加了擴(kuò)散速度,有利于有效成分的溶出。當(dāng)固液比大于1∶30(g/mL)時(shí),隨著固液比增大葛根素得率下降,可能是隨著溶劑量的繼續(xù)增加,降低了酶的有效作用濃度和催化活性,從而使葛根素得率降低[20]。從浸提效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷這三方面綜合考慮,溶劑用量不宜過(guò)大。同時(shí)溶劑用量過(guò)大也會(huì)增加提取成本。

圖2 酶解固液比對(duì)葛根素得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratios on yield of puerarin

2.2.3 酶添加量對(duì)葛根素得率的影響 酶添加量對(duì)葛根素得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著酶添加量的增加,葛根素得率隨之增大,當(dāng)酶添加量大于1.5mL/g時(shí),葛根素得率增幅減小,可能因?yàn)楦鸶欣w維素成分含量一定,當(dāng)其全部被纖維素酶的結(jié)合位點(diǎn)所結(jié)合后,即使再加酶也無(wú)多余的底物來(lái)進(jìn)行酶解反應(yīng)。添加過(guò)量的酶也會(huì)增加酶解反應(yīng)的不均勻性,從而影響酶解速率,所以葛根素得率增加度較小[21-22]。從1.5mL/g酶添加量2.5mL/g比1.5mL/g時(shí)的葛根素得率只提高了1.82%,從經(jīng)濟(jì)成本和效率方面考慮,較佳的酶添加量為1.5mL/g。

圖3 酶添加量對(duì)葛根素得率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on yield of puerarin

2.3 纖維素酶結(jié)合超聲波提取葛根素的響應(yīng)面優(yōu)化研究

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇影響葛根素得率的三個(gè)主要酶解因素:固液比(X1)、酶解時(shí)間(X2)、酶添加量(X3),以葛根黃酮的主要成分葛根素得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of response surface methodology

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.05b對(duì)表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到因子X(jué)1(固液比)、X2(酶解時(shí)間)、X3(酶添加量)與響應(yīng)值Y(葛根素得率)間的關(guān)系方程為:Y=0.72-0.007793X1+0.008908X2-0.013X3-0.028X1X2-0.005178X1X3+0.013X2X3-0.026X12-0.038X22+0.003787X32,R2=0.9250。

表4 二次多項(xiàng)模型及其各項(xiàng)方差分析Table 4 Variance analysis of second order polynomial equation

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析及顯著性評(píng)價(jià),由表4可見(jiàn),該模型p=0.0035<0.01,失擬項(xiàng)p=0.1096,表明該模型失擬不顯著,回歸極顯著。一般認(rèn)為,相關(guān)系數(shù)R2大于0.9,表明預(yù)測(cè)值能與實(shí)驗(yàn)值具有高度相關(guān)度[23],該方程系數(shù)R2=0.9250,進(jìn)一步說(shuō)明回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合性較好,能夠解釋葛根素得率的變化,可以應(yīng)用于酶解提取葛根素得率的理論預(yù)測(cè)。

依據(jù)模型參數(shù)F值的大小,各影響因素對(duì)響應(yīng)目標(biāo)值葛根素得率的影響程度依次為酶添加量>酶解時(shí)間>固液比。此外,一次項(xiàng)中X3的回歸系數(shù)顯著,說(shuō)明酶添加量對(duì)葛根素得率有顯著影響;交互項(xiàng)中X1與X2的偏回歸系數(shù)極顯著,說(shuō)明固液比與酶解時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)葛根素得率有顯著(p<0.05)影響,而其余的交互作用不顯著。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素(X1、X2、X3)所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,根據(jù)回歸方程,將一個(gè)影響因子固定在其中心水平(Xn=0),得到其它兩個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面,可以直觀的從圖5、圖6看出。

圖4 固液比與酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的響應(yīng)面曲面圖Fig.4 Response surface of the solid-liquid ratio and hydrolysis time on the yield of puerarin

圖5 固液比與酶添加量對(duì)葛根素得率的響應(yīng)面曲面圖Fig.5 Response surface of the solid -liquid ratio and enzyme dosage on the yield of puerarin

圖6 酶解時(shí)間與加酶量對(duì)葛根素得率的響應(yīng)面曲面圖Fig.6 Response surface of the hydrolysis time and enzyme dosage on the yield of puerarin

通過(guò)回歸模型理論預(yù)測(cè)酶粉葛提取葛根素的最佳條件為X1為1∶31.35,X2為9.81,X3為1,即固液比1∶31.35,酶解時(shí)間9.81h、酶添加量為1mL/g(31.84U/g),在此條件下從粉葛提取葛根素的理論預(yù)測(cè)值可達(dá)0.723%。考慮到實(shí)際操作的可行性,將酶法結(jié)合超聲波提取粉葛葛根素的最佳反應(yīng)條件修正為:固液比1∶31,酶解時(shí)間9.8h,加酶量1mL/g。

2.4 纖維素酶結(jié)合超聲波提取葛根素最優(yōu)工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用固液比1∶31(g/mL),酶解時(shí)間9.8h、酶添加量為1mL/g進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),共進(jìn)行4 次實(shí)驗(yàn),平均值為0.728%,與預(yù)測(cè)值0.723%較為接近,相對(duì)誤差為0.69%,比優(yōu)化前(0.631%)提高了15.37%,比傳統(tǒng)乙醇浸提法(0.569%)和單純超聲波提取法(0.584%)分別提高了28.0%和24.7%,表明本文建立的酶法結(jié)合超聲波提取粉葛葛根素最優(yōu)工藝條件,既能提高提取得率,又具有一定的可靠性和重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本論文以提高葛根素提取得率為目的,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化研究,建立了纖維素酶結(jié)合超聲波提取粉葛葛根素的最優(yōu)工藝條件,即固液比1∶31(g/mL)、酶解解時(shí)間9.8h、酶添加量31.84U/g,超聲功率150W、頻率40kHz、時(shí)間30min。在該條件下,葛根素的提取得率達(dá)0.728%,比優(yōu)化前提高了15.37%,比傳統(tǒng)乙醇浸提法(0.569%)和單純超聲波提取法(0.584%)分別提高了28.0%和24.7%。

2010 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定,粉葛葛根素含量應(yīng)不低于干燥品質(zhì)量的0.30%方可入藥[2]。本文所選用的葛根品種總黃酮得率達(dá)到2.1%,葛根素得率達(dá)到0.728%,符合藥用要求。其鮮葛根淀粉含量高達(dá)70.9%,可廣泛應(yīng)用于保健食品行業(yè),具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該品種已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的種植加工,是綜合開(kāi)發(fā)利用葛根資源的較優(yōu)選擇。

目前工業(yè)中常用的醇水提取方法中有效成分提取率低、工序復(fù)雜等問(wèn)題,而酶解與超聲提取法兩種提取技術(shù)連用可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),在溫和可控制的條件下提取出更多的黃酮類(lèi)物質(zhì),在保健食品及藥物開(kāi)發(fā)中具有很大的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用潛力。

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Research of enzymatic hydrolysis assisted ultrasonic forextraction of puerarin from Kudzu

LI Tian-tian1,FU Shu2,3,LIU Xiao-feng2,LI Dong2,WANG Shu-ya1,ZHENG Tao1,*

(1.Collage of Biotechnology and Pharmaceutical,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China;2.Chengdu Institute of Biology,Academy of Sciences,Chengdu 610041,China;3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

To increase yield of puerarin,enzymatic hydrolysis assisted ultrasonic extraction was used to extract puerarin from Kudzu. A Box-Benhnken design(BBD)involving three main variables such as solid-liquid ratio,enzymatic time and enzyme dosage at three levels was employed based on single factor experiments. The optimal values of these variables were determined by response surface analysis. The optimal conditions were as follows:solid-liquid ratio of 1∶31(g/mL),enzymatic time of 9.8h and enzyme dosage of 31.84U/g. Moreover,the validity of the established model was verified. The experimental yield of puerarin of 0.728% was in good agreement with the predicted one of 0.723%,which was 15.37% higher than unoptimized group and separately 24.7% and 28.0% higher than ultrasonic extraction and ethanol extraction methods.

cellulase;Kudzu;Puerarin;factors;response surface analysis

2014-08-21

李甜甜(1989-),女,碩士,研究方向:天然產(chǎn)物提取。

*通訊作者:鄭濤(1982-),男,博士,研究方向:生物質(zhì)能源化利用、生物電化學(xué)合成、天然產(chǎn)物綠色提取技術(shù)等。

中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(KLCAS-2013-05);江蘇省自然科學(xué)基金(BK20130932);江蘇省高校自然科學(xué)基金(13KJB530009)資助。

TS201.1

B

1002-0306(2015)13-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.028