響應(yīng)面法優(yōu)化灰黑平菇富硒培養(yǎng)條件

賴 穎,葛紅蓮,崔曉弢

(周口師范學(xué)院,生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,河南周口 466001)

響應(yīng)面法優(yōu)化灰黑平菇富硒培養(yǎng)條件

賴 穎,葛紅蓮,崔曉弢

(周口師范學(xué)院,生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,河南周口 466001)

目的:為了優(yōu)化富硒平菇的生長(zhǎng)配方,以周口農(nóng)科院提供的平菇菌種為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其進(jìn)行了耐硒范圍的測(cè)定。方法:通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法Box-behnken Design(BBD)優(yōu)化實(shí)驗(yàn),采用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽法測(cè)定不同成分比例條件下平菇中的硒含量。結(jié)果:單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:最佳初始硒含量為300mg/kg培養(yǎng)料,麥麩含量的最佳值是200g/kg棉籽殼,蔗糖含量的最佳值是12g/kg棉籽殼。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出適宜富硒平菇生長(zhǎng)的最佳配方為:麥麩200.14g/kg、蔗糖11.77g/kg、初始硒含量318.27mg/kg。在此條件下的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,平菇的硒含量為2.1859mg/kg,與預(yù)測(cè)含量為2.1878mg/kg接近。結(jié)論:通過多元回歸擬合方程,所得的回歸方程可以正確反映麥麩、蔗糖、初始硒含量與平菇中硒含量之間的關(guān)系,說明預(yù)測(cè)模型適用、可靠,可應(yīng)用于富硒平菇發(fā)酵條件的優(yōu)化。

富硒平菇,Box-Behnken設(shè)計(jì),培養(yǎng)條件

硒是人體必需的微量元素,與人類和動(dòng)物的健康密切相關(guān),已證明在某些地區(qū)流行的克山病、大骨關(guān)節(jié)病,牲畜所患的白肌病與缺硒有關(guān),通過補(bǔ)硒可使疾病得到控制[1]。研究發(fā)現(xiàn)低硒與心血管病、肝病、癌癥的發(fā)病有關(guān)[2]。人體內(nèi)的硒大多從平時(shí)的食物中獲得,但食物中硒的含量通常比較低,很難滿足人體的需要。而無機(jī)硒的毒性通常又比較高,所以能將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的方法得到了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。平菇味甘、溫,具有追風(fēng)散寒、舒筋活絡(luò)的功效,可用于治療腰腿疼痛、手足麻木、筋絡(luò)不通等病癥[3]。平菇含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),蛋白質(zhì)含量高,氨基酸種類齊全,礦物質(zhì)豐富[4]。硒蛋氨酸(Se-Mef)庫是動(dòng)物體內(nèi)最重要的硒代謝庫之一,而平菇中氨基酸種類齊全,所以富硒平菇的研究有很重要的意義。在國外已有很多國家研究富硒平菇并且實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)[5]。但是,國內(nèi)有關(guān)富硒平菇發(fā)酵生產(chǎn)的報(bào)道還不多,對(duì)最適宜的培養(yǎng)條件研究的還不是很清楚,實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)還不太現(xiàn)實(shí),因此研究富硒平菇顯得尤為必要。本研究選用農(nóng)科院提供的平菇菌種,對(duì)其富硒能力進(jìn)行研究,優(yōu)化富硒平菇的發(fā)酵工藝條件,為進(jìn)一步研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰黑平菇江都109 周口市農(nóng)科院提供;蔗糖,亞硒酸鈉,濃硝酸,乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na),甲酸,甲苯,3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB),濃氨水,95%乙醇 分析純;平菇發(fā)酵培養(yǎng)基 棉籽殼80%,麥麩19%,蔗糖1%,pH自然,121℃,滅菌2h。

LDZX-40KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DGF30電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;容聲BCDR23冰箱 廣東容聲電器股份有限公司;HH-S型水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;JJ-2組織搗碎機(jī) 金壇市杰瑞爾電器有限公司;UV-5100紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硒含量的測(cè)定 采用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺比色法進(jìn)行測(cè)定[6]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 初始硒含量單因素實(shí)驗(yàn) 將固體培養(yǎng)基按照棉籽殼800g、麥麩190g、蔗糖10g的配方進(jìn)行混勻,配制9份。將系列濃度的Na2SeO3溶液與固體栽培料混勻,制成硒含量分別為50、100、150、200、250、300、350、400、450mg(以Se計(jì))/kg(培養(yǎng)基)?；靹蚝蠓謩e裝袋,封口,保證其不漏空氣,并分別貼上標(biāo)簽1、2、3、4、5、6、7、8、9。將培養(yǎng)料在高溫滅菌鍋中以121℃的溫度滅菌2h。將滅菌的培養(yǎng)基放在超凈工作臺(tái)上,晾12h左右,直到其溫度降至室溫,然后在超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)上用鑷子進(jìn)行接種,注意接種量要保持一致。封緊袋子,將其放在陰涼、潮濕的地方,遮光培養(yǎng)。培養(yǎng)至所有的袋子都爬滿白色菌絲,將袋口剪開,均勻地灑上水,讓其仍然在陰涼的地方生長(zhǎng)。每天要在早、中、晚三次灑水,水量不要太多,灑水要均勻。注意觀察菌絲的生長(zhǎng)情況,每5d測(cè)量一次菌絲的長(zhǎng)度。平菇生長(zhǎng)成熟后,及時(shí)采摘,并在每一份平菇中稱取20g,然后加水180mL進(jìn)行打漿,用量筒測(cè)量漿液體積,分別寫上序號(hào)。從每份漿液取40mL倒入100mL,加入適量的硝酸溶液,調(diào)節(jié)pH2～3。后面的操作步驟與繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟一樣,得到每組平菇中的硒含量(mg/kg成熟平菇質(zhì)量)。

1.2.2.2 麥麩含量的單因素實(shí)驗(yàn) 選取上述最優(yōu)初始硒含量,將固體培養(yǎng)基中蔗糖10g,棉籽殼隨麥麩的量變化而變化保證培養(yǎng)料的質(zhì)量一定,加入麥麩為80、100、120、140、160、180、200、220、240g/kg培養(yǎng)基,充分混勻后分別裝袋并貼上標(biāo)簽,嚴(yán)格滅菌后在超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)上接種。后面采用1.2.2.1步驟處理。

1.2.2.3 蔗糖含量的單因素實(shí)驗(yàn) 將固體培養(yǎng)基按照上述實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)棉籽殼與麥麩的比例混勻,然后在9份中分別加入蔗糖7、8、9、10、11、12、13、14、15g充分混勻后制成在硒元素單因素實(shí)驗(yàn)獲得的初始硒含量最佳的培養(yǎng)基。分別裝袋并貼上標(biāo)簽,后面采用1.2.2.1步驟處理。

1.2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中確定的平菇培養(yǎng)基成分的最佳配比范圍,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)[7-11]。采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn),本次實(shí)驗(yàn)采用了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方法[12]。按照軟件設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行培養(yǎng)基的配制。裝袋完成后進(jìn)行嚴(yán)格滅菌并在超凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)接種,放在陰涼潮濕的地方。待其菌絲爬滿培養(yǎng)基時(shí),拆袋處理,并按時(shí)灑水直到平菇生長(zhǎng)成熟。實(shí)驗(yàn)方案如表1:

表1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of the response surface method design

1.2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件分析得到最優(yōu)組合之后,按照最優(yōu)組合配制培養(yǎng)基,并分裝成三袋進(jìn)行滅菌處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及分析

2.1.1 初始硒含量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖1可以看出,在一定的范圍內(nèi),平菇中的硒含量隨著培養(yǎng)基中的初始硒含量增加而增加,初始硒含量從50mg/kg增加到100mg/kg過程中,平菇中的硒含量增速較快,說明此階段菌體吸收硒的能力強(qiáng),有可能自身生長(zhǎng)也需要硒元素。初始硒含量由100mg/kg增加到300mg/kg,平菇中的硒含量增速變緩,并達(dá)到最大值1.9301mg/kg,說明有可能菌體同化硒元素的能力已經(jīng)達(dá)到臨界狀態(tài)。因此,在此條件下,最適宜平菇生長(zhǎng)的初始硒含量為300mg/kg,選擇平菇富硒適宜的初始硒含量范圍為250～350mg/kg。

圖1 初始硒含量對(duì)平菇中的硒含量的影響Fig.1 Effect of the initial selenium content on selenium content of Mushroom

2.1.2 麥麩的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖2可以看出,在麥麩含量為200g/kg時(shí),平菇109中的硒含量也最高,為2.0037mg/kg,平菇107在麥麩低于200g/kg時(shí)平菇中的硒含量逐步增加,菌體自身生長(zhǎng)較快,吸收硒元素的能力較強(qiáng),高于200g/kg時(shí)菌體吸收硒元素的能力有所降低,可能由于麩皮的添加了過多,菌體生長(zhǎng)受到抑制,吸收能力降低,確定最佳麥麩添加量的范圍是180～220g/kg。

圖2 麥麩對(duì)平菇中的硒含量的影響Fig.2 The influence of wheat gluten on selenium content of Mushroom

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analyzation of mean square

注:***差異極顯著(p<0.001);**差異高度顯著(p<0.01);*差異顯著(p<0.05)。

2.1.3 蔗糖的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖3可以看出,在蔗糖含量為12g/kg時(shí),平菇109中的硒元含量最高,為2.0188mg/kg。而平菇在蔗糖低于12g/kg時(shí),可能由于碳源不足導(dǎo)致平菇吸收硒元素緩慢,高于12g/kg平菇自身可能受到抑制,降低了硒元素的吸收。因此,確定添加蔗糖的最適范圍是11～13g/kg。

圖3 蔗糖對(duì)平菇中的硒含量的影響Fig.3 The influence of sugar on selenium content of Mushroom

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面法分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以麥麩、蔗糖以及初始硒含量(硒元素量)為自變量,平菇109中硒含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2:

表2 響應(yīng)面法分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2 Scheme and results of the response surface design

2.2.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立及分析 用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,對(duì)該模型進(jìn)行方差分析,見表3,得二次回歸模型如下:Y=-29.31970+0.12734A+1.98035B+0.044689C-0.00320062A2-0.07127B2-0.005861C2-0.00225AB+0.001075AC-0.0081BC。如表3所示,該模型極顯著,失擬性不顯著,初始硒含量(C)、麥麩的平方項(xiàng)(A2)、初始硒含量的平方項(xiàng)(C2)對(duì)最終平菇中的硒含量的影響極其顯著,蔗糖的平方項(xiàng)(B2)對(duì)平菇中的硒含量的影響高度顯著,蔗糖和初始硒含量的交互作用(BC)影響顯著,其他項(xiàng)均不顯著。比較F的大小,得出對(duì)平菇中硒元素含量影響大小順序是:C2,C,A2,B2,BC,B,AC,AB,A。該模型擬合度較好,能夠擬合麥麩、蔗糖、硒元素對(duì)硒含量的影響。三個(gè)因素的影響順序?yàn)?C(初始硒含量)>B(蔗糖)>A(麥麩)。

2.3 雙因素交互作用的分析

從圖4可以看出,當(dāng)蔗糖或者麥麩的量固定時(shí),平菇中的硒含量隨著麩皮或者蔗糖的量的增加呈先提高后降低的趨勢(shì),二者有較為明顯的交互作用。從圖5可以看出,隨著初始硒含量的增加,平菇中的硒含量呈先增加再減少的趨勢(shì),當(dāng)初始硒含量的值一定時(shí),平菇中的硒含量隨著麩皮的量的增加同樣呈現(xiàn)現(xiàn)增加后降低的趨勢(shì),二者具有較為明顯的交互作用。從圖6可以看出,隨著蔗糖的量的增加,平菇中的硒含量呈先增加再減少的趨勢(shì),而當(dāng)蔗糖的量一定時(shí),平菇中的硒含量而隨著初始硒含量的增加而先逐漸增加,而后逐漸趨于平緩有些下降趨勢(shì),二者交互作用顯著。因此,交互作用的影響順序?yàn)?BC(硒元素與蔗糖的交互作用)>AC(初始硒含量與麥麩的交互作用)>AB(麥麩與蔗糖的交互作用)。

圖4 麥麩與蔗糖的交互作用對(duì)硒含量的影響曲面圖Fig.4 Response surface graph of wheat bran and sucrose on the effects of selenium content

圖5 初始硒含量與麥麩的交互作用對(duì)硒含量的影響曲面圖Fig.5 Response surface graph of initial Selenium and wheat bran on the effects of selenium content

利用Design Expert軟件的Optimization命名進(jìn)行條件尋優(yōu),響應(yīng)值硒含量選最大值,最終結(jié)果為為麥麩200.14g/kg、蔗糖11.77g/kg、初始硒含量318.27mg/kg,在這樣的配方下平菇中的硒含量達(dá)到最大,預(yù)測(cè)含量為2.1878mg/kg。最終優(yōu)化結(jié)果如圖7所示。

圖6 初始硒元素與蔗糖的交互作用對(duì)硒含量的影響曲面圖Fig.6 Response surface graph of initial Selenium and sucrose on the effects of selenium content

圖7 最終優(yōu)化結(jié)果圖Fig.7 The final optimization results

2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

在上述優(yōu)化條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),求出每一組平菇的硒元素含量分別為2.1911、2.1867、2.1798mg/kg。求平均數(shù)可以得出平菇中的硒含量為2.1859mg/kg,與響應(yīng)面法預(yù)測(cè)值2.1878mg/kg非常接近,說明預(yù)測(cè)模型可用。

3 結(jié)論與討論

單因素實(shí)驗(yàn)確定了富硒平菇發(fā)酵培養(yǎng)基的亞硒酸鈉的適宜的添加范圍、麥麩的適宜的添加范圍、蔗糖的適宜的添加范圍。在此基礎(chǔ)上用響應(yīng)面法BBD實(shí)驗(yàn)建立了以硒含量為響應(yīng)值的二次回歸模型。最終得到富硒平菇發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為:麥麩200.14g/kg、蔗糖11.77g/kg、初始硒含量318.27mg/kg。在此條件下的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,平菇中的硒含量為2.1859mg/kg,與預(yù)測(cè)含量為2.1878mg/kg接近,說明預(yù)測(cè)模型可用。富硒發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的平菇的硒含量達(dá)到了2.1859mg/kg,與單因素實(shí)驗(yàn)中的最高值2.01875mg/kg相比,硒含量增加了8.28%,說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化富硒發(fā)酵培養(yǎng)基是有效的,這也為富硒平菇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。另外,在平菇發(fā)酵結(jié)束后,培養(yǎng)基中尚殘存一定量的無機(jī)硒,如果直接排放,不但浪費(fèi)了資源,而且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。如何合理、有效的利用這部分硒資源,還有待于進(jìn)一步研究。與傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)法只能找出最佳值,僅限于所選用的幾個(gè)水平,難以直觀地判斷優(yōu)化區(qū)域相比,響應(yīng)面法更直觀,且更有效地建立了自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系。相對(duì)于只用多元回歸方程模型來分析因子與響應(yīng)的關(guān)系,響應(yīng)面方法用擬合面的方式來完成具有更直觀、更清楚的優(yōu)點(diǎn)。

[1]杜苗.HG-AFS測(cè)定富硒水果中的硒量[J].中國科技博覽,2012,23(2):73-74.

[2]白文軍,鄧德江.蘑菇:自然的饋贈(zèng)-馴化的蘑菇:人工栽培[J].北京農(nóng)業(yè):實(shí)用技術(shù),2013(5):25-27.

[3]李以暖,薛立文.富硒保健食品硒含量標(biāo)準(zhǔn)的探討[J].廣東微量元素科學(xué),2000,7(5):18-21.

[4]劉國平,劉玉春,鄧正春,等.富硒平菇生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,24:40-41.

[5]王新風(fēng),楊芳,劉圣師,等.富硒平菇蛋白測(cè)定與氨基酸成分分析[J].食品科學(xué),2008,29(12):610-613.

[6]熊彪,周大寨,鄧禮君.3.3′-二氨基聯(lián)苯胺比色法測(cè)定薇菜中的微量硒[J].食品研究與開發(fā),2013:24(01):84-85

[7]楊華,紀(jì)明山,李廣旭,等.不同發(fā)酵條件對(duì)蘋果輪紋病拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)的影響[J].果樹學(xué)報(bào),2007,24(6):799-802

[8]張帥,董基,黃志明,等.響應(yīng)面法優(yōu)化富鉻靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基[J].食品科學(xué),2013,34(15):208-212.

[9]楊其義,趙祥穎,劉建軍.響應(yīng)面法優(yōu)化木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基[J].山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,27(2):34-38.

[10]CAI Menghao,ZHOU Xiangshan,SUN Xueqian,et al. Statistical optimization of medium composition for aspergiolide A production by marine-derived fungus Aspergillus glaucus[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2009,36(3):381-389

[11]REN Dadun,WANG Ling,XIE Kai,et al. Optimization of Culture C omponents for Laccase Activity from Pleurotus Ostreatus.[J].Joumal of Donghua University,2013,30(4):305-310.

[12]張丹鶴,秦小冬.利用超聲波輔助酶法提取馬尾藻多糖條件優(yōu)化[J].吉林農(nóng)業(yè):學(xué)術(shù)版.2011,12:71-73.

Optimization of culture conditions for therich seleniumMushroomby response surface method

LAI Ying,GE Hong-lian,CUI Xiao-tao

(College of Life Science and Agriculture,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

Objective:Mushroomspawn provided by Zhoukou Academy were tested for its resistance to selenium range. Method:Through single factor experiment and response surface methodology Box-behnken Design(BBD)optimization test. 3,3′- diaminobenzidine hydrochloride method was applied to determine the selenium content ofMushroomunder the conditions of different components and proportion. Result:The results of single factor experiment showed as follows:the optimum value of appropriate selenium content forMushroommycelium growth was 300mg/kg training materials,the best value of wheat bran content was 200g/kg cottonseed hulls,the optimum value of sucrose content was 12g/kg cottonseed hulls. The optimum SeMushroomgrowth formula was determined by response surface experiment:wheat bran 200.14g/kg cottonseed hulls,sucrose 11.77g/kg cottonseed hulls,selenium 318.27mg/kg training materials. The measured value of selenium content ofMushroomwas 2.1859mg/kg,under the optimal conditions,which was well consistent with the predicted value of 2.1878mg/kg. Conclusion:This research for the rich seleniumMushroomprovided theory basis for the scale of production,and had a certain reference value.

rich seleniumMushroom;Box-Behnken design;culture conditions

2014-07-22

賴穎(1981-)，女，碩士研究生，講師，主要從事發(fā)酵、生物能源方面的研究。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.023