不同分子量鹿茸多肽抗氧化活性的研究

劉春娟

(1.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130012;2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130025)

不同分子量鹿茸多肽抗氧化活性的研究

劉春娟

(1.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130012;2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130025)

本文利用膜分離技術(shù)獲得不同分子量段的鹿茸多肽,采用五種抗氧化檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行全面的抗氧化活性分析,獲得抗氧化活性較好的多肽Ⅲ片段,分子量在6214u以下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)濃度在0.1～10.0mg/mL范圍之間,多肽Ⅲ對(duì)超氧陰離子自由基清除能力和對(duì)還原能力低于VC;當(dāng)濃度為10.0mg/mL時(shí),多肽Ⅲ對(duì)DPPH自由基的清除能力與VC基本相當(dāng);當(dāng)濃度在8.0～10.0mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率和對(duì)脂質(zhì)體氧化抑制能力高于VC。

鹿茸多肽,抗氧化活性,不同分子量,膜分離技術(shù)

鹿茸是一種國(guó)內(nèi)外常用名貴滋補(bǔ)品和中藥材。鹿茸中含有多種生物活性物質(zhì),在臨床上被用于多種疾病的治療。鹿茸多肽是鹿茸中重要的生物活性物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗疲勞、促進(jìn)組織愈合和修復(fù)等作用[1]。目前獲得鹿茸多肽的方法以酶解鹿茸蛋白,分離純化降解產(chǎn)物為主[2-3]。因此運(yùn)用現(xiàn)代化的科學(xué)技術(shù)從酶解液中分離多肽,尋找出具有代表性的生物活性物質(zhì),將對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)的意義。

本文首次利用膜分離技術(shù)將鹿茸蛋白酶解產(chǎn)物按分子量不同進(jìn)行分段,獲得不同分子量段的鹿茸多肽,并采用多種抗氧化檢測(cè)方法測(cè)定其抗氧化活性,以期得到抗氧化活性較好的鹿茸多肽,為拓寬鹿茸的應(yīng)用途徑——天然抗氧化劑,提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿茸(二杠,帶血茸) 購(gòu)自長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)梅花鹿養(yǎng)殖戶;Papain木瓜蛋白酶 丹麥諾維信公司;抗壞血酸(VC)為化學(xué)對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司;DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazy hydrate) Sigma公司;多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品(3496～14200u) 美國(guó)Amersham公司。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2550 島津國(guó)際貿(mào)易有限公司;433D全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)SYKAM;DYY-8C電泳儀 DYCZ-24D電泳槽,北京市六一儀器廠;MSC300超濾杯 上海膜速科學(xué)器材有限公司;聚醚砜膜,膜面積0.002m2,截留分子量為10、5、3ku 北京安得膜分離技術(shù)工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 采用超高壓技術(shù)提取[4]鹿茸蛋白,經(jīng)凍干得到鹿茸蛋白凍干粉。稱取鹿茸蛋白凍干粉進(jìn)行酶解[5],將酶解液按分子量不同分成三段多肽,選用截留分子量為3、5、10ku的膜片,用分子量為0.2ku的膜片對(duì)3ku膜下液進(jìn)行濃縮。得到三段分子量范圍為5～10ku的多肽Ⅰ,3～5ku的多肽Ⅱ,0.2～3ku的多肽Ⅲ。

1.2.2 多肽含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]測(cè)定蛋白水解液中多肽的含量。

1.2.3 DPPH清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]。用無(wú)水乙醇配制DPPH溶液2×10-4mol/L,避光,保存?zhèn)溆?。精確吸取2mL樣品于試管中,加入2mL DPPH溶液,充分混合、搖勻,水浴(27℃)30min后倒入比色皿中,于517nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i,同樣測(cè)定2mL樣品液和2mL無(wú)水乙醇的吸光度值A(chǔ)j以及2mL DPPH溶液加入2mL蒸餾水的吸光度值A(chǔ)0。用蒸餾水作空白。DPPH自由基清除率(P)計(jì)算公式:

P(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

平行測(cè)定三次,取平均值。

1.2.4 羥自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]。在干燥的試管中分別加入2.0mmol/L硫酸亞鐵溶液1.5mL、30mmol/L過(guò)氧化氫溶液1.5mL、6.0mmol/L水楊酸溶液1.5mL,振蕩,搖勻,于37℃水浴,15min后取出,在510nm處測(cè)其吸光度A0,然后加入樣液2.0mL,振蕩,搖勻,于37℃水浴15min后取出,測(cè)其吸光度A。清除率計(jì)算公式為:

清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100

平行測(cè)定三次,取平均值。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[9]。在干燥的試管中加入4.5mL 0.05mol/L的Tris-HCL緩沖溶液(pH8.2),4.0mL去離子水,0.2mL待測(cè)樣液,混勻后,置于25℃恒溫水浴10min。取出后迅速加入0.3mL(25℃溫浴10min)的鄰苯三酚溶液(3mmol/L,10mmol/L HCL配制),混勻后立即在320nm下測(cè)定,每隔30s測(cè)定1次吸光度值,記錄4min內(nèi)吸光度值的變化,并求出其變化斜率,用10mmol/L HCL代替鄰苯三酚做空白調(diào)零。用去離子水代替樣品溶液同樣方法測(cè)定4min內(nèi)吸光度值的變化,并求出其變化斜率。平行測(cè)定三次,取平均值。清除率計(jì)算公式為:

清除率(%)=[(k0-k)/k]×100

式中:k0為空白管吸光度值變化斜率;k為樣品管吸光度值變化斜率。

脂質(zhì)體氧化抑制率P(%)=[(A0-Ai)/A0]×100

1.2.7 還原能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]。吸取樣品液2mL于試管中,加入2mL磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L,pH6.6)和2mL鐵氰化鉀溶液(1%)。充分混勻,放置于50℃水浴20min,冷卻到室溫后,然后在反應(yīng)混合物中加入2mL三氯乙酸溶液(10%),混合后離心(3000r/min)10min,取上清液2mL,加入2mL蒸餾水及0.4mL三氯化鐵溶液(0.1%),反應(yīng)10min后,測(cè)定其在700nm處的吸光度值,樣品還原能力越強(qiáng),吸光度值就會(huì)越大。平行測(cè)定三次,取平均值。

1.2.8 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE) 采用小分子多肽常用的電泳分析法Tricine-SDS-PAGE電泳[16-17]。將樣品與緩沖液按一定比例混合,取上清液10μL進(jìn)行分析。

1.2.9 氨基酸組分測(cè)定 采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定水解液中氨基酸的含量,具體測(cè)定方法參照GB/T 18246-2000。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量鹿茸多肽DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其乙醇溶液呈紫色,在517nm附近有強(qiáng)吸收,當(dāng)有自由基清除劑加入DPPH溶液時(shí),溶液顏色變淺,吸收減弱,吸收減弱的程度可以評(píng)價(jià)某種活性物質(zhì)的抗氧化能力,DPPH自由基的清除率越大,說(shuō)明物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)[18-20]。測(cè)定不同濃度的多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ對(duì)DPPH自由基的清除率,與VC進(jìn)行比較,由圖1可以看出,VC對(duì)DPPH自由基的清除率非常高,多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ對(duì)DPPH自由基的清除能力,在低濃度時(shí)明顯弱于VC,當(dāng)多肽濃度為10.0mg/mL時(shí),多肽Ⅲ與VC對(duì)DPPH自由基的清除能力基本相當(dāng)。

圖1 DPPH自由基清除能力比較Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging ability

2.2 不同分子量鹿茸多肽羥自由基清除能力

采用水楊酸比色法測(cè)定羥自由基清除能力,根據(jù)Fenton反應(yīng)原理,反應(yīng)體系中的水楊酸能捕捉·OH,生成在510nm處有最大吸收峰的有色物質(zhì),吸光值與·OH的量成正比,如果向反應(yīng)體系中加入具有清除·OH能力的物質(zhì),會(huì)減少水楊酸和·OH的結(jié)合,吸光值降低,即可測(cè)出被測(cè)物·OH清除率。由圖2可以看出,三種多肽段對(duì)羥自由基清除能力在0.1～10.0mg/mL濃度范圍內(nèi),隨著多肽濃度的增加而增大。其中在高濃度8.0～10.0mg/mL下,多肽Ⅲ對(duì)羥自由基的清除率高于VC,表現(xiàn)出了較強(qiáng)的對(duì)羥自由基的清除能力。

圖2 羥自由基清除能力比較Fig.2 Comparison of hydroxyl radicals scavenging ability

2.3 不同分子量鹿茸多肽超氧陰離子自由基清除能力

圖3 超氧陰離子自由基清除能力比較Fig.3 Comparison of superoxide anion radical scavenging ability

2.4 不同分子量鹿茸多肽脂質(zhì)體氧化抑制能力

脂質(zhì)體氧化法是一種模擬細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化的體外實(shí)驗(yàn)方法。鹿茸多肽對(duì)脂質(zhì)體氧化抑制能力結(jié)果如圖4所示。當(dāng)多肽濃度超過(guò)4.0mg/mL之后,多肽Ⅱ和多肽Ⅲ對(duì)脂質(zhì)體氧化抑制能力高于VC。研究顯示蛋白質(zhì)(多肽)的乳化性與分子中疏水性基團(tuán)的數(shù)量、種類及其在分子中分布有關(guān)。酶水解作用可能導(dǎo)致緊密的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象被破壞,從而使被包埋于分子內(nèi)部的疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來(lái),易于與脂類結(jié)合,形成穩(wěn)定的乳化體系[22]。相對(duì)水溶性的VC來(lái)說(shuō),有良好的乳化性能的多肽能夠有效抑制卵磷脂分散體系中脂質(zhì)體過(guò)氧化。

2.5 不同分子量鹿茸多肽還原能力

采用普魯士藍(lán)反應(yīng)法測(cè)定鹿茸多肽的還原能力。在還原劑(樣品)的作用下,K3Fe(CN)6被還原成K4Fe(CN)6,然后會(huì)與Fe3+反應(yīng)形成普魯士藍(lán)K4(Fe(CN)6)3,普魯士藍(lán)在700nm處有最大吸收峰,其吸光度值越高,普魯士藍(lán)的生成量越大,表明還原劑還原能力越強(qiáng)[23]。 由圖5可知,在0.1～10.0mg/mL濃度范圍內(nèi),三種多肽段的吸光度值明顯低于同濃度的VC,說(shuō)明三種多肽段的還原能力相對(duì)于VC來(lái)說(shuō)比較差。

圖4 脂質(zhì)體氧化抑制能力比較Fig.4 Comparison of liposome oxidation inhibitory ability

圖5 還原能力比較 Fig.5 Comparison of reducing power

2.6 Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果分析

SDS-PAGE利用蛋白質(zhì)分子量不同對(duì)其進(jìn)行分離,是一種經(jīng)濟(jì)、快速、易于操作且可重復(fù)的方法,現(xiàn)已成為在許多研究領(lǐng)域中一種重要的分析技術(shù)。鹿茸多肽(多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ)Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜見(jiàn)圖6。從圖中可以看到,在6000u到10000u附近,多肽Ⅰ條帶較清晰;多肽Ⅱ分子量集中在3496u到8159u之間;抗氧化性相對(duì)較好的多肽Ⅲ因?yàn)榉肿恿枯^小,分離效果不理想,但從圖中可以看出主要部分的分子量在6214u以下。

圖6 鹿茸多肽Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 Tricine-SDS-PAGE analysis of velvet antler peptide注:M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1-多肽Ⅰ;2-多肽Ⅱ;3-多肽Ⅲ。

2.7 鹿茸多肽氨基酸組成分析

從不同體外抗氧化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出,總體抗氧化能力最強(qiáng)的組分是多肽Ⅲ。對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果如表1。檢測(cè)結(jié)果為氨基酸占總固形物的百分含量。

表1 多肽Ⅲ氨基酸組成Table 1 Composition of amino acid of peptide Ⅲ

有文獻(xiàn)研究顯示許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力,如Leu、Gly、Ala、Glu、Asp、His、Tyr等。其中由于抗氧化肽具有Ala、Val、Leu疏水性的非極性脂肪烴側(cè)鏈,加強(qiáng)了其與疏水性多不飽和脂肪酸相互作用,含有這些疏水性氨基酸的多肽能夠通過(guò)與氧的結(jié)合,抑制脂質(zhì)中氫的釋放,脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)被延緩,從而對(duì)脂質(zhì)體系起到保護(hù)作用,起到抗氧化的作用[24]。由表1可以看出,多肽Ⅲ中三種氨基酸:Leu含量為7.69%,Glu含量為6.15%,Gly含量為5.01%,相對(duì)而言含量非常高,因此多肽Ⅲ在脂質(zhì)體氧化抑制能力的測(cè)定時(shí)顯現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制力。

3 結(jié)論

通過(guò)五種方法比較不同分子量大小鹿茸多肽的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)分子量最小的鹿茸多肽Ⅲ具有最高的抗氧化活性,分子量在6214u以下。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)研究顯示,當(dāng)濃度在0.1～10.0mg/mL范圍之間,多肽Ⅲ對(duì)超氧陰離子自由基清除能力和對(duì)還原能力低于VC;當(dāng)濃度為10.0mg/mL時(shí),多肽Ⅲ對(duì)DPPH自由基的清除能力與VC基本相當(dāng);當(dāng)濃度在8.0～10.0mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率和對(duì)脂質(zhì)體氧化抑制能力高于VC。因此鹿茸多肽Ⅲ具有成為一種天然抗氧化劑的潛力。

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Study on antioxidant activity of antler peptideswith different molecular weight

LIU Chun-juan

(1.Jilin Province Economic Management Cadre College,Changchun 130012,China;2.College of Biology and Agriculture Engineering,Jilin University,Changchun 130025,China)

Antler peptides with different molecular weight cutoff were prepared by membrane technology and their antioxidant activities were evaluated by five kinds of methods. The results indicated that the antioxidant activity of peptide III was the best,and its molecular weight was less than 6214u. The ability of O-2·free radical scavenging and the reducing of the peptide III were weaker than that of VCwhen their concentration was in the range of 0.1～10.0mg/mL,and the ability of DPPH· free radical scavenging of the peptide III was the same as VCwhen their concentration was 10.0mg/mL. But the ability of hydroxyl radicals scavenging and the liposome oxidation inhibition of the peptide III were higher than that of VCwhen their concentration was in the range of 8.0～10.0mg/mL.

velvet antler peptides;antioxidant activity;different molecular weight;membrane technology

2014-09-02

劉春娟(1977- ) ，女，博士，副教授, 研究方向：從事食品及天然產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 30472135);長(zhǎng)春市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(08KZ35)。

TS202.1

A

1002-0306(2015)13-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.002