響應(yīng)面法優(yōu)化核桃降壓肽的酶解工藝研究

盧 娣,吳慶智,毛曉英,*,陳國剛,邵 理

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000;2.石河子開發(fā)區(qū)神內(nèi)食品有限公司,新疆石河子 832000)

響應(yīng)面法優(yōu)化核桃降壓肽的酶解工藝研究

盧 娣1,吳慶智2,毛曉英1,*,陳國剛1,邵 理1

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000;2.石河子開發(fā)區(qū)神內(nèi)食品有限公司,新疆石河子 832000)

本研究以低溫脫脂核桃粕為原料,采用堿溶酸沉提蛋白后,分別用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶制備核桃多肽,以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-I-Converting Enzyme,ACE)抑制率和水解度為指標(biāo),選出酶解效果最好的酶,并且對其底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解溫度、酶解時間和pH進行單因素實驗,在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面實驗優(yōu)化其制備核桃降壓肽的最佳水解工藝。結(jié)果表明:在底物質(zhì)量濃度30g/L、加酶量8000U/g、酶解溫度57℃和pH8.6的條件下水解3h,ACE抑制率可達(dá)64.32%,此時酶解液的水解度為21.57%。

核桃粕,堿性蛋白酶,ACE抑制肽,酶解,響應(yīng)面分析

高血壓是一種常見的心腦血管疾病,會引起心血管、大腦、腎臟的病變[1]。降壓肽是一種ACE抑制劑,通常用于高血壓患者的治療[2]。目前,對高血壓患者的治療通常使用化學(xué)合成的藥物,然而,這些合成藥物有一些副作用,包括咳嗽和皮疹[3]。食源性降壓肽來源于天然植物,無副作用,易被人體吸收[4]。不同的植物來源,降壓功效作用也是不同的。

目前,研究者已經(jīng)從不同的食物中利用發(fā)酵、酶解等方法提取了不同序列的降壓肽,如:玉米、大豆、花生、米糠、杏仁等,在一定程度上起到了降血壓的作用[5-7]。但是對以核桃粕為原料提取降壓肽的研究較少。實驗以核桃粕為原料,制備降壓肽,在一定程度上拓展了食源性降壓肽原料的來源,其降壓活性也很顯著。核桃粕是核桃經(jīng)過提取油后的副產(chǎn)物,含有29.65%蛋白質(zhì),提油后的核桃粕多數(shù)被用作飼料,資源造成了一定的浪費,酶解核桃粕蛋白制備降壓肽可以促進核桃粕的深加工,實現(xiàn)資源的綜合利用。研究采用酶法水解蛋白質(zhì),其條件溫和,對多肽活性的影響較小,過程容易控制[8-9]。本實驗以脫脂核桃粕為原料,以水解度和ACE抑制率為指標(biāo),首先通過比較四種商業(yè)化蛋白酶對核桃蛋白的酶解效果確定最佳用酶,然后用響應(yīng)面法對其工藝進行優(yōu)化。本研究為核桃粕的綜合利用和核桃的深加工提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕 康福壽核桃油加工有限公司;2709堿性蛋白酶(Alcalase)和中性蛋白酶 均購于北京博奧拓達(dá)科技有限公司;木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶 均購于sigma公司;FAPGG(呋喃丙烯酰三肽) 購于sigma公司;ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶) 購于sigma公司;正己烷、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉等均為分析純。實驗用水均為去離子水。

快速恒溫數(shù)顯水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;PHS-3 C雷磁pH計 上海精科儀器;BS 2000 S電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;FDU-1200冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;ELx 808酶標(biāo)儀 Thermo公司;SH 21-1磁力攪拌器 上海梅穎浦儀表制造有限公司;DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 技術(shù)路線

低溫脫脂核桃粕→過60目篩→脫脂→提取核桃蛋白→酶解用酶的優(yōu)化→堿性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化→核桃ACE抑制肽酶解液

1.3 核桃脫脂粉的制備

核桃粕經(jīng)粉碎后過60目篩,用正己烷以1∶5(g/mL)的料液比在磁力攪拌器上提取1h后進行抽濾,取濾渣重復(fù)用正己烷提取至濾液無色透明時收集濾渣,然后用恒溫干燥箱烘干溶劑,置于冰箱4℃冷藏備用。

1.4 核桃蛋白的提取

采用堿溶酸沉法提取核桃蛋白。參照毛曉英[10]的方法,略改。以核桃脫脂粉為原料,通過95%醇洗(1∶10,g/mL),過濾,把濾餅置恒溫干燥箱烘干溶劑。然后用去離子水配制蛋白質(zhì)溶液(1∶26,w/v),用2.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白液的pH到11.0,置磁力攪拌器上53℃攪拌1.5h后7000r/min 25℃離心15min,取上清液,用2.0mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5,攪拌1h,7000r/min 25℃離心15min,水洗沉淀,調(diào)節(jié)pH至中性后用冷凍干燥機凍干,置于冰箱4℃冷藏備用。

1.5 酶解工藝

稱取一定量核桃蛋白,加去離子水配制成一定濃度的水解底物于水浴鍋中90℃10min處理后,調(diào)至最適的pH,加入一定量蛋白酶,調(diào)至最適溫度于水浴鍋中水解一段時間后于90℃10min滅酶終止反應(yīng),8000r/min離心15min取上清液,測定ACE抑制率和水解度。

1.6 蛋白酶的篩選

分別將堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶8000U/g加入濃度20g/L的蛋白質(zhì)溶液中,按照1.5酶解工藝于每種酶最適的pH和溫度下水解4h,測定ACE抑制率和水解度。

表1 四種商業(yè)酶最適作用條件和酶活力Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes

1.7 核桃降壓肽制備的單因素實驗和響應(yīng)面實驗設(shè)計

以核桃降壓肽的ACE抑制率和水解度為指標(biāo)分別考察溫度(℃)、底物質(zhì)量濃度(g/L)、加酶量(U/g)、酶解時間(h)和pH五個因素對核桃降壓肽制備的影響,進行單因素實驗。

在單因素研究的基礎(chǔ)上,選取最優(yōu)的溫度(℃)、底物質(zhì)量濃度(g/L)、加酶量(U/g)和pH四個因素為響應(yīng)變量,以ACE抑制率為響應(yīng)值,設(shè)計響應(yīng)面分析實驗。因素水平及編碼表見表2。

表2 因素水平及編碼表Table 2 The table of factors and level

1.8 檢測指標(biāo)

1.8.1 水解度的測定 采用pH-Stat法[11]。

1.8.2 ACE抑制率的測定 在96孔酶標(biāo)板上按表3設(shè)計添加反應(yīng)物開始反應(yīng),在340nm波長條件下,用酶標(biāo)儀測吸光值A(chǔ)1。使其在37℃的恒溫培養(yǎng)條件下反應(yīng)30min,測量吸光度A2,作3組平行實驗[12]。

ACE抑制率的計算公式如下:

ΔA=A1-A2

式中:ΔAb為加入緩沖基質(zhì)時吸光度在30min內(nèi)的變化;ΔAa為加入抑制劑時吸光度在30min內(nèi)的變化。

表3 ACE抑制活性的測定Table 3 The determination of ACE inhibition activity

注:1.FAPGG(1.0mmol/L):取3.994mg FAPGG加基質(zhì)緩沖液2,定容至10mL,溶解混合,置4℃避光放置;2.基質(zhì)緩沖液1:pH8.3、100mmol/L的硼酸緩沖液;3.基質(zhì)緩沖液2:pH8.3、100mmol/L的硼酸緩沖液(含300mmol/L NaCl)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解蛋白酶的篩選

將上述的四種蛋白酶在各自的最適酶解條件下對核桃蛋白進行酶解,以ACE抑制率和水解度為指標(biāo),選出制備核桃降壓肽的最適用酶,結(jié)果見圖1。

圖1 四種酶解液的ACE抑制率及其水解度的比較Fig.1 Comparison the four kind of enzyme solution on ACE inhibition rate and hydrolysis degree

由圖1可以得到,不同蛋白酶對核桃粕蛋白的水解能力存在明顯差異,這與蛋白酶的底物特異性有關(guān)[13]。其中水解液的ACE抑制率和水解度相對較高的是堿性蛋白酶。ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系研究表明,強ACE抑制活性肽的C-端氨基酸傾向于疏水性氨基酸。堿性蛋白酶的酶切位點在疏水氨基酸的C-端,當(dāng)C-端為疏水性氨基酸時,小肽具有較強的ACE活性[14]。研究報道表明,核桃脫脂粉和核桃蛋白分離組分的氨基酸組成中,以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量較高,且主要以酸性氨基酸和疏水性氨基酸為主[10]。風(fēng)味蛋白酶的作用范圍較廣,但是其對核桃蛋白的水解力相對較弱,中性蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸的羧基參與形成的肽鍵,木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶,具有較寬的底物特異性。研究結(jié)果表明,堿性蛋白酶對核桃蛋白的水解能力明顯高于風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜白酶,說明核桃蛋白的結(jié)構(gòu)中存在較多的堿性蛋白酶的作用位點,從而更有利于ACE抑制肽的釋放。此外,這與宋亮等人[5]以玉米為原料和孔令明等人[7]以杏仁為原料酶法制備ACE抑制肽報道的結(jié)果比較相似。綜合考慮選擇堿性蛋白酶為最適酶。

2.2 堿性蛋白酶的酶解工藝

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 pH對水解度和酶解液ACE抑制率的影響 由圖2可以看出,pH對堿性蛋白酶水解核桃蛋白有顯著影響。在pH為8.5時酶解液ACE抑制率和水解度達(dá)到最大值,隨著pH的繼續(xù)增大,ACE抑制率和水解度都相對有所減小。這說明較高pH可能導(dǎo)致堿性蛋白酶的失活,不利于水解。選擇最佳酶解pH為8.5。

圖2 pH對酶解液ACE抑制率和水解度影響Fig.2 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by pH

2.2.1.2 底物質(zhì)量濃度對水解度和酶解液ACE抑制率的影響 由圖3可知,隨著底物質(zhì)量濃度的增大,ACE抑制率和水解度先增大后減小,由于酶解初期隨著底物質(zhì)量濃度增大多肽含量增加,故ACE抑制率和水解度增大,在底物質(zhì)量濃度為30g/L時達(dá)到最大值,繼續(xù)增大底物質(zhì)量濃度,ACE抑制率和水解度都相對有所減小,原因可能是隨著底物質(zhì)量濃度的增大,酶解液的有效水分含量過低,減少了在反應(yīng)過程中底物和蛋白酶間碰撞的機會,對水解產(chǎn)生抑制的作用[15]。選擇最適底物質(zhì)量濃度為30g/L。

圖3 底物質(zhì)量濃度對酶解液ACE抑制率和水解度影響Fig.3 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by substrate concentration

2.2.1.3 酶解溫度對水解度和酶解液ACE抑制率的影響 由圖4可知,隨著溫度的增加,酶解液的ACE抑制率和水解度均呈現(xiàn)增大的趨勢,當(dāng)酶解溫度為55℃時達(dá)到最大值,持續(xù)升高溫度反而會減小,這可能是因為在一定的范圍內(nèi)隨著溫度的增加,有利于酶解反應(yīng)的進行。當(dāng)溫度過高時,導(dǎo)致酶蛋白變性,使酶活減弱。選擇最適溫度為55℃。

圖4 酶解溫度對酶解液ACE抑制率和水解度影響Fig.4 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by temperature

2.2.1.4 加酶量對水解度和酶解液ACE抑制率的影響 由圖5可知,隨著加酶量的增大,酶解液的ACE抑制率和水解度增大,在加酶量為7000U/g時ACE抑制率達(dá)到最大值,原因可能是隨著酶濃度的增加,有利于酶與底物的結(jié)合,對酶解有促進的作用。隨著加酶量的繼續(xù)增大,酶解液的ACE抑制率和水解度略有降低,原因可能是一部分具有ACE抑制活性的多肽被進一步水解成不具有降壓活性的小肽。故選擇7000U/g為最適加酶量。

圖5 加酶量對酶解液ACE抑制率和水解度影響Fig.5 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by enzyme dosage

2.2.1.5 酶解時間對水解度和酶解液ACE抑制率的影響 由圖6可知,當(dāng)酶解時間從1.5h開始,隨著酶解時間的延長水解度和ACE抑制率呈逐漸增大趨勢,3h后酶解液的水解度上升緩慢,這可能是因為在反應(yīng)的初始階段,蛋白酶和底物均處于較高的濃度水平,酶解反應(yīng)速率較大,隨著反應(yīng)的進行,堿性蛋白酶的濃度逐漸降低,酶解產(chǎn)物濃度增加,其競爭抑制性增強,酶的活性隨著反應(yīng)的進行而降低,導(dǎo)致在3h以后增加酶解時間,ACE抑制率和水解度增加緩慢。故選擇酶解時間為3h。

圖6 酶解時間對酶解液ACE抑制率和水解度影響Fig.6 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and hydrolysis degree by time

2.2.2 各因素之間的交互作用 實驗發(fā)現(xiàn)在影響酶解過程的主要因素溫度(℃)、底物質(zhì)量濃度(g/L)、加酶量(U/g)、酶解時間(h)和pH中,過高或過低的溫度(℃)、底物質(zhì)量濃度(g/L)、加酶量(U/g)和pH對酶解液的ACE抑制率有顯著影響。從酶解時間對酶解液ACE抑制率的影響的曲線中可以看出,當(dāng)酶解時間超過3h時,酶解液的ACE抑制率和水解度增加緩慢,因此確定酶解時間為3h,避免過長時間造成的能源消耗。故在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以溫度(℃)、底物質(zhì)量濃度(g/L)、加酶量(U/g)和pH為響應(yīng)變量,以ACE抑制率(%)為響應(yīng)值,采用四因素三水平對核桃蛋白酶解物進行響應(yīng)面分析實驗,結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 The design and results of the response surface experimental

對表4進行回歸分析,以ACE抑制率(%)為響應(yīng)值建立的二次響應(yīng)面回歸方程如下:

Y=62.33600+8.62583A+2.99583B+2.77083C+2.22750D-1.99750AB-1.21750AC-3.20250AD-0.37500BC+1.41000BD-3.21500CD-8.84300A2-5.84550B2-4.53550C2+0.38450D2

對回歸方程進行方差分析,結(jié)果見表5。

表5 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 5 Decolorization regression model and analysis of variance

2.2.3 最佳條件的響應(yīng)面優(yōu)化 由圖7、圖8和圖9直觀地反映了各因素的交互作用?？梢钥闯?隨著底物質(zhì)量濃度的增大,ACE抑制率先增加后降低,說明在實驗實驗范圍內(nèi)存在酶水解的最佳底物質(zhì)量濃度,當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠摰孜镔|(zhì)量濃度時,都會影響ACE的抑制率。同樣,對于加酶量、酶解溫度和pH都存在適合堿性蛋白酶水解的最佳值。因此,在實驗所選擇的因素水平范圍中存在最優(yōu)的酶解條件組合使得核桃降壓肽的ACE抑制率達(dá)到最大。

圖7 底物質(zhì)量濃度和加酶量交互作用響應(yīng)曲面Fig.7 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by substrate concentration and enzyme dosage

圖8 加酶量和酶解溫度交互作用響應(yīng)曲面Fig.8 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by enzyme dosage and temperature

圖9 加酶量和酶解溫度交互作用響應(yīng)曲面Fig.9 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by enzyme dosage and pH value

2.2.4 驗證實驗 利用Design-Expert 8.0軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合,得到堿性蛋白酶酶解核桃蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝為:底物質(zhì)量濃度28.99g/L、加酶量8000U/g、pH8.64,酶解溫度56.67℃,ACE抑制率可達(dá)到66.45%。根據(jù)實驗室條件調(diào)整酶解工藝為底物質(zhì)量濃度30g/L、加酶量8000U/g、pH8.6,酶解溫度57℃,得到的實際抑制率64.32%,相對誤差2.13%,此時酶解液的水解度為21.57%。

由此可看出實際測出值與理論值相差不大,說明響應(yīng)面優(yōu)化對堿性蛋白酶水解核桃蛋白制備ACE抑制肽的工藝參數(shù)是可行的。研究人員采用不同核桃品種通過酶解制備降壓肽進行了研究,朱振寶[16]等用Alcalase 2.4L酶解核桃分離蛋白,在酶解工藝條件為pH7.94,酶解溫度60℃,底物質(zhì)量濃度30g/L,酶與底物質(zhì)量比3.69∶100,酶解3h得到抑制率為76.58%的ACE抑制肽,包怡紅等[17]用堿性蛋白酶酶解山核桃蛋白在酶解工藝條件為pH8.2,酶解溫度56℃,加酶量5800U/g,酶解4h得到抑制率為72.48%的ACE抑制肽,對比研究工藝條件和研究結(jié)果表明,本研究中所用方法得到的ACE抑制肽的抑制率接近同領(lǐng)域研究者研究的鮮核桃制備ACE抑制肽的抑制率。

3 結(jié)論

本研究分別用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解核桃蛋白制備核桃降壓肽,以ACE抑制率和水解度為指標(biāo),對比結(jié)果篩選堿性蛋白酶為最適酶。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面實驗,以ACE抑制率為指標(biāo),確定了堿性蛋白酶水解工藝的最佳參數(shù)為底物質(zhì)量濃度30g/L、酶添加量8000U/g、pH8.6、酶解溫度57℃,得到的酶解液的水解度為21.57%,實際抑制率可達(dá)到64.32%。本研究得到了較高的ACE抑制率結(jié)果為核桃粕的深加工提供了一定的指導(dǎo)方向,從而為進一步拓寬核桃產(chǎn)業(yè)提供思路和理論指導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of enzymatic hydrolysis of ACE in inhibition peptides from walnut protein by response surface method

LU Di1,WU Qing-zhi2,MAO Xiao-ying1,*,CHEN Guo-gang1,SHAO Li1

(1. Food College,Shihezi University,Shihezi 832000,China；2. Shennei Food Limited Company,Shihezi Development Zoon,Shihezi 832000,China)

In this paper,walnut protein,extracted form defatted walnut meal and then was separated by alkaline extraction-isoelectric precipitation technique,was hydrolyzed by four protease(alkaline protease,neutral protease,papain and flavor protease)for production of antihypertensive peptides. As an index,ACE inhibitory rate and the degree of hydrolysis were determined to select the proper enzyme with best enzymatic effect. Then single factor experiments were carried out to research the effects of the factors such as substrate concentration(g/L),enzyme dosage(U/g),hydrolysis time(h),hydrolysis temperature(℃)and pH. The response surface methodology was used to optimize conditions of the enzymatic hydrolysis. The results showed that the optimum conditions were substrate concentration 30g/L,enzyme dosage 8000U/g,temperature 57℃,pH8.6 and time of enzymatic hydrolysis 3h. The ACE inhibition rate could reach 64.32% and the degree of hydrolysis was 21.57%.

walnut meal;alkaline protease;ACE inhibition peptide;enzymatic hydrolysis;response surface methodology

2014-10-08

盧娣(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：果蔬加工及貯藏。

*通訊作者:毛曉英(1976-),女，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

石河子大學(xué)優(yōu)秀青年項目(2013ZRKXYQ14)。

TS229

B

1002-0306(2015)11-0233-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.039