綠茶多糖的乙?；揎椉捌淝宄杂苫?、活性的研究

梁少茹,肖 霄,肖 斌,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 ,陜西楊陵 712100;2.北京林業(yè)大學(xué)林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點實驗室 ,北京 100083)

梁少茹1,肖 霄2,肖 斌1,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院 ,陜西楊陵 712100;2.北京林業(yè)大學(xué)林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點實驗室 ,北京 100083)

綠茶多糖,乙?；?自由基,亞硝基,清除活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 來自西北農(nóng)林科技大學(xué)茶葉實驗站;無水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮、氫氧化鈉、過氧化氫、乙酸酐、鄰二氮菲、鄰苯三酚、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、鹽酸羥胺、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

AL-204分析天平電子天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;UV3802準(zhǔn)雙光束紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;TGL-18M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠茶多糖的提取與純化 綠茶多糖的提取與純化方法[10-11]如下:綠茶茶葉粉碎,過30目篩,按茶水比1∶20在55℃下水浸提2.5h,趁熱過濾,55℃溫度條件下減壓濃縮至原體積的三分之一,加入3倍體積95%乙醇沉淀,沉淀物用丙酮、無水乙醇、乙醚交替洗滌3次,經(jīng)Sevag 法脫蛋白、過氧化氫脫色,再經(jīng)透析后凍干即為純化茶多糖(TPS)。

1.2.2 茶多糖的乙?；揎椉白罴研揎棗l件確定 茶多糖乙?；揎椃椒╗8]如下:取綠茶多糖樣品0.5g加入到10mL蒸餾水中并混勻,用0.5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH為9.0,一定溫度(20～40℃)保溫,其間交替向溶液中加入一定量的乙酸酐和0.5mol/L的氫氧化鈉以保持溶液pH為8.0。反應(yīng)期間溫度控制在20～40℃,乙酸酐加入量為10～20mL,保溫時間為3～5h。反應(yīng)結(jié)束后,用5mol/L鹽酸調(diào)整溶液的pH為7.0,冷卻后將混合液置于透析袋中流水透析3d,再經(jīng)減壓濃縮、醇沉、冷凍干燥后即得乙?；瓒嗵?Acetylated tea polysaccharides,A-TPS)。乙?；嗵堑娜〈炔捎脡A性羥胺比色法[12]進(jìn)行測定,先繪制乙酰基濃度與其吸光度(A=540nm)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測出樣品中乙?；?然后計算取代度。取代度計算公式:

式中,W為茶多糖中乙?；?。

通過分析比較,保溫時間(A)、茶多糖與乙酸酐的體積比(B)、反應(yīng)溫度(C)是影響反應(yīng)進(jìn)程的主要因素[13],以取代度為指標(biāo),通過單因素實驗對各因素進(jìn)行考察,得出各因素水平取值。選擇這3個指標(biāo)作為實驗三因素,設(shè)計三因素三水平的正交實驗,參照上述乙?；瓒嗵切揎椃椒?按L9(34)正交表進(jìn)行實驗,研究得到最高取代度乙?；瓒嗵堑姆磻?yīng)條件。正交實驗因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

超氧陰離子清除率=(A0-A1)/A0×100%

式中,A0為對照組吸光值,A1為樣品組吸光值。

1.2.4 茶多糖及其乙?；a(chǎn)物清除羥自由基(·OH)活性的測定 茶多糖及其乙?；a(chǎn)物清除·OH活性的測定采用鄰二氮菲-Fe氧化法[15]進(jìn)行:精確移取5mmol/L鄰二氮菲溶液(用蒸餾水將50mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋制得)1.5mL,加入50mmol/L pH7.4磷酸緩沖液2.0mL,充分混勻,滴加1.0mL 7.5mmol/L FeSO4溶液,加好后立即混勻,分別加1mL不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)茶多糖或其乙?；a(chǎn)物溶液,最后加0.1% H2O21.0mL啟動反應(yīng),以水補充體積至10mL作為樣品管,損傷管中加H2O2不加樣品溶液,未損傷管兩者均不加,損傷管、未損傷管均以水補充體積至10mL,各管反應(yīng)液均置于37℃保溫60min,取出后在波長536nm處測吸光值。根據(jù)下式計算羥自由基清除率:

羥自由基清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中,A0為未損傷管吸光值,A1為損傷管吸光值,A2為樣品管吸光值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 正交實驗結(jié)果分析用Minitab15進(jìn)行分析,使用SPSS statistics 19進(jìn)行顯著性分析,文中其他圖表使用EXCEL完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙?；瓒嗵堑暮铣芍苽浼靶揎棗l件的優(yōu)化

水提醇沉法提取綠茶多糖得粗茶多糖提取率為2.07%,經(jīng)過脫色和6次除蛋白得到初步純化茶多糖。以保溫時間(A)、茶多糖質(zhì)量與乙酸酐體積比(B)、反應(yīng)溫度(C)作為實驗三因素,以制得的純化多糖為原料,參照表1各因素水平進(jìn)行正交實驗。表2為實驗因素水平表和正交實驗結(jié)果及極差分析表,正交實驗重復(fù)三次,表2中取代度為三次實驗平均值。

表2 正交實驗結(jié)果及極差分析表Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

由表2可知,三個實驗因素對取代度的影響作用由大到小依次為:茶多糖質(zhì)量與乙酸酐體積比(B)>保溫時間(A)>反應(yīng)溫度(C),正交實驗得到的最適條件為茶多糖質(zhì)量與乙酸酐體積比為1∶40,保溫時間4h,反應(yīng)溫度為30℃。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗證實驗,制得乙?；瓒嗵堑娜〈葹?.337,表明該優(yōu)選條件穩(wěn)定可行,重復(fù)性良好。以該正交實驗獲得的最佳反應(yīng)條件制取乙?；瓒嗵?并進(jìn)行以下清除自由基及亞硝基的實驗。

圖1 茶多糖與乙?；瓒嗵?對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

2.3 茶多糖及乙酰化茶多糖對羥自由基(·OH)的清除作用

羥自由基是一種氧化活性很強的氧化劑,可直接損傷各種生物膜,導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,·OH清除率是抗氧化作用的重要指標(biāo)[3]。本實驗采用鄰二氮菲-Fe氧化法測定綠茶多糖及其乙?；a(chǎn)物對·OH的清除作用,實驗結(jié)果見圖2。

圖2 綠茶多糖與乙?；G茶多糖對羥自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

由圖2可知,茶多糖及其乙酰化產(chǎn)物對·OH的清除作用與溶液濃度正相關(guān),且乙?；瓒嗵乔宄钚跃哂谖葱揎椙?·OH清除活性最大提高率達(dá)36.96%。此外,當(dāng)溶液濃度為本實驗范圍內(nèi)最大即1mg/mL時,乙?；瓒嗵堑摹H清除率達(dá)到最大值60.36%,說明乙?；瓒嗵蔷哂休^強的·OH清除活性，表明乙?；揎椖軌蛴行У靥岣卟瓒嗵菍ΑH的清除活性。

圖3 綠茶多糖與乙?；G茶多糖對亞硝基的清除作用Fig. scavenging effect of TPS and acetylated TPS

圖4 乙?；揎棽瓒嗵侨〈扰c清除活性的關(guān)系Fig.4 Relationship between modification degree and scavenging effect of acetylated tea polysaccharides

3 討論

4 結(jié)論

[1]宛曉春.茶葉生物化學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003,54-55,419-420.

[2]Chen H X,Zhang M,Xie B J. Components and antioxidant activity of polysaccharide conjugate from green tea[J]. Food Chemistry,2005,90(1-2):17-21.

[3]于淑池,侯金鑫.龍井茶多糖對自由基和NO2-清除作用研究[J].食品研究與開發(fā),2012,33(4):28-31.

[4]錢賓賓.多糖化學(xué)修飾方法探究[J]. 科技創(chuàng)新導(dǎo)報,2012(8):137.

[5]麻冬濱,東方,季宇彬.多糖結(jié)構(gòu)修飾研究進(jìn)展[J].黑龍江科技信息,2013(3):53-54.

[6]陳新仁,吳瓊,鄭成.銀耳多糖的分子修飾及抗氧化作用的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2013(17):17-18,38.

[7]魏玉,王元蘭,何新建.低分子量k_卡拉膠的制備、分子修飾及其生物活性研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2009,30(4):344-348.

[8]梁進(jìn),張劍韻,崔瑩瑩,等.茶多糖的化學(xué)修飾及體外抗凝血作用研究[J].茶葉科學(xué),2008,28(3):166-171.

[9]劉阿娟,張靜,張化朋,等.虎奶菇菌核多糖的化學(xué)修飾及活性研究[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2014,42(1):105-108.

[10]倪德江,陳玉瓊,謝筆鈞,等.綠茶、烏龍茶、紅茶的茶多糖組成抗氧化及降血糖作用研究[J].營養(yǎng)學(xué)報,2004,26(1):57-60.

[11]余志,石玉濤,倪德江.酶法修飾綠茶多糖對免疫低下模型小鼠免疫活性的影響[J]. 茶葉科學(xué),2010,30(zl):567-572.

[12]郭曉強,何鋼,姚倩,等.乙?；y耳多糖的制備及其取代度測定[J].食品工業(yè)科技,2013,34(12):255-257.

[13]宋逍,張麗華,趙鵬,等.響應(yīng)面法優(yōu)選款冬花多糖的乙酰化工藝研究[J].中成藥,2013,35(9):2030-2033.

[14]張海容.修飾多糖的抗氧自由基活性及其與DNA結(jié)合機(jī)理的熒光法研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2003:54.

[15]彭永華.茶多糖的化學(xué)修飾及其衍生物的降血糖活性研究[D].無錫:江南大學(xué)，2006:35.

[16]焦中高,劉杰超,周紅平,等.硫酸化修飾對紅棗多糖自由基和亞硝基清除活性的影響[J].中國食品學(xué)報,2007,7(2):17-21.

[17]Macdonald J,Galley H F,Webster N R. Oxidative stress and gene expression in sepsis[J]. British journal of anaesthesia ,2003,90(2):221-232.

[18]林桂蘭,許學(xué)書,連文思.食用菇多糖提取物體外抗氧化性能研究[J].華東理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,32(3):278-281.

[19]Frazier C E ,Wendler S L,Glasser W. Long chain branched celluloses by mild trans-glycosidation[J]. Carbohydrate Polymers,1996,31(1-2):11-18.

[20]張難,吳遠(yuǎn)根,周劍麗,等.多糖的分子修飾及其在功能性食品中的應(yīng)用展望[J].食品研究與開發(fā),2007,28(8):159-163.

LIANG Shao-ru1,XIAO Xiao2,XIAO Bin1，*

(1.College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

2014-09-09

梁少茹(1987-)，女，碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學(xué)。

*通訊作者:肖斌(1957-)，男，學(xué)士，教授，主要從事茶葉生理生態(tài)及茶葉生物化學(xué)研究。

國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-23)；陜西省科技統(tǒng)籌工程計劃難題招標(biāo)(2013KTZB02-01-01)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.009