黑果枸杞中多酚的體外消化及其抗氧化性研究

樓舒婷,林雯雯,孫玉敬,李 昕,潘俊嫻,葉興乾,3,*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院食品系,浙江杭州 310014;3.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

黑果枸杞中多酚的體外消化及其抗氧化性研究

樓舒婷1,林雯雯1,孫玉敬2,李 昕1,潘俊嫻1,葉興乾1,3,*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院食品系,浙江杭州 310014;3.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

以黑果枸杞為原料,研究了化學(xué)提取法和體外消化法兩種不同提取方式對(duì)多酚含量的影響。同時(shí),采用DPPH、FRAP、ABTS和ORAC四種不同方法測(cè)定了枸杞提取物的抗氧化性。結(jié)果表明,體外消化處理后的總酚和總花色苷含量低于化學(xué)提取法,而酚酸含量則高于后者;總體上,化學(xué)提取法的抗氧化性高于體外消化法;兩種提取方法處理后的總酚和總花色苷與各化學(xué)抗氧化值均有較高的線(xiàn)性相關(guān)性(R2>0.83)。而體外消化法中,酚酸與各化學(xué)抗氧化值的相關(guān)性(R2>0.68)明顯高于化學(xué)提取法(R2>0.03)。

黑果枸杞,多酚,體外消化,抗氧化作用

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.),主要分布于我國(guó)青海、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古和西藏等地區(qū)。據(jù)記載,黑果枸杞果實(shí)具有強(qiáng)腎潤(rùn)肝、明目健胃的作用,也可用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)等,在民間多作為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、降壓藥使用[1-2]。此外,部分地區(qū)廣泛加工枸杞品種的葉片和根作為飲用泡茶[3]。

黑果枸杞果實(shí)中含有豐富的類(lèi)胡蘿卜素,維生素B1、維生素B2、維生素C,還富含F(xiàn)e、Zn、Se等無(wú)機(jī)元素[3],其提取物也有較強(qiáng)的抗氧化作用[4]。但目前關(guān)于黑果枸杞果實(shí)中多酚物質(zhì)體外消化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了化學(xué)提取和體外消化兩種提取方式對(duì)枸杞多酚含量的影響,并且采用常用的四種化學(xué)抗氧化方法(DPPH、FRAP、ABTS和ORAC)測(cè)定其抗氧化性,分析抗氧化作用與各酚類(lèi)物質(zhì)含量的相關(guān)性,為黑果枸杞在醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)及保健食品中的應(yīng)用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 1,6-二(二苯基膦基)己烷(DPPH·)、水溶性維生素E(Trolox)、原兒茶素、兒茶素、咖啡酸、綠原酸等 美國(guó)Sigma公司;ABTS、AAPH、熒光素鈉 阿拉丁試劑有限公司;鹽酸、無(wú)水乙醇、醋酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

枸杞來(lái)源:黑果枸杞選自常見(jiàn)的且產(chǎn)量相對(duì)豐富的新疆維吾爾自治區(qū)和青海省,同時(shí)以紅果枸杞(產(chǎn)地新疆)作為參照對(duì)比。分別簡(jiǎn)稱(chēng)為新疆黑枸杞、青海黑枸杞和新疆枸杞。

1.1.2 儀器 UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司;PB-10型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;Waters2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀 Thermo公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA) 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞的樣品制備 化學(xué)提取:取三種枸杞各2g,加入30mL 50%乙醇50℃水浴浸提1.5h,過(guò)濾后將殘留物加入20mL乙醇(50%,v/v),浸提1h后過(guò)濾。合并濾液,定容至50mL。體外消化:采用Rufián-Henares等[5]和Pastoriza等人[6]的方法,并作一定優(yōu)化。取三種枸杞各2g,加入20mL蒸餾水,加入α-淀粉酶/CaCl2溶液500μL(32.5mg α-淀粉酶溶解于25mL 1mmol/L CaCl2,pH7.0)。混合物在37℃振蕩水浴10min后,再用6N HCl溶液將混合物調(diào)節(jié)至pH2.0,以0.05g胃蛋白酶/g樣品的濃度加入胃蛋白酶,并將該混合物于37℃在振蕩水浴1h。滴加0.9mol/L NaHCO3緩沖液調(diào)節(jié)至pH6.0,加入5mL胰酶-膽汁溶液(0.1g胰酶和0.625g膽汁鹽溶解于25mL 0.1mol/L NaHCO3)。然后用0.9mol/L NaHCO3將pH調(diào)節(jié)至7.4,于37℃溫育2h。為確保酚類(lèi)化合物的穩(wěn)定性,最后用6N HCl將消化產(chǎn)物的pH調(diào)節(jié)至2.0,10000r/min離心10min。取上清液并稀釋至50mL。

1.2.2 總酚的測(cè)定 采用Bao等人的方法[7],并作一定修改。取400μL提取液,加入1mL 1mol/L福林酚試劑,并用去離子水定容至2mL。室溫下暗處理5min,再加入5mL 5% Na2CO3溶液,混勻后在室溫下反應(yīng)1h。最后,用分光光度計(jì)在765nm下測(cè)定吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為沒(méi)食子酸當(dāng)量/gDW(GAE)。

1.2.3 總花色苷的測(cè)定 取500μL待測(cè)液,分別用pH1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖液定容于10mL,暗處理30min后于510、700nm處測(cè)量吸光值。按照相關(guān)公式計(jì)算總花色苷含量(mg/gDW)。

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式中:A510為510nm處的吸光值;A700為700nm處的吸光值;MW為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷分子量(449.2);DF為待測(cè)液稀釋倍數(shù);為消光系數(shù)(29600l/moL·cm);l為光路長(zhǎng)度(cm);V為待測(cè)液體積(mL);M為樣品重量(g)。

1.2.4 酚酸的測(cè)定 采用Zhou等[8]的方法,并作一定修改。取25mL提取液,用6N HCl調(diào)節(jié)至pH2.0。再采用乙醚/乙酸乙酯(1∶1,v/v)溶液萃取四次。收集水相,用無(wú)水硫酸鈉干燥脫水。旋蒸至干后,用甲醇定容至2mL,過(guò)0.2μm有機(jī)濾膜,備用。高效液相色譜條件:色譜柱為L(zhǎng)C-20高效色譜儀,迪馬C18反向色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為4%乙酸∶甲醇(20∶80,v/v);流速:1mL/min;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:40℃;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):260nm和320nm。

1.2.5 DPPH法 采用Benzie等人[9]的方法,并作一定修改。配制0.1mmol/L的DPPH·乙醇溶液,貯存于棕色瓶中。取2.8mL DPPH·乙醇溶液和0.2mL 樣品溶液混合,室溫下暗處理30min,于517nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。樣品抗氧化能力以抗壞血酸當(dāng)量(TEAC)表示。

1.2.6 FRAP法 采用Bao等人[7]的方法,并作一定修改。配制FRAP 試劑:0.1mol/L 醋酸緩沖溶液(pH3.6)∶10mmol/L TPTZ(溶于40mmol/L鹽酸)∶20mmol/L三氯化鐵=10∶1∶1。取1.0mL樣品提取液,加入5.0mL FRAP 試劑,反應(yīng)10min后在593nm下測(cè)定吸光值。樣品抗氧化能力以抗壞血酸當(dāng)量(TEAC)表示。

1.2.7 ABTS法 采用Bao等人[7]的方法,并作一定修改。取440μL 140mmol/L過(guò)硫酸鉀加入25mL濃度為7mmol/L的ABTS 溶液中混合,室溫下暗處理12～16h,形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。在波長(zhǎng)734nm處,用50%乙醇將ABTS+自由基儲(chǔ)備液稀釋至吸光度為0.70±0.02。移取0.1mL樣品提取液,加入3.9mL ABTS+溶液,室溫下反應(yīng)10min,于波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光值。樣品抗氧化能力以抗壞血酸當(dāng)量(TEAC)表示。

1.2.8 ORAC法 采用Wang等人[10]的方法,并作一定修改。配制504mmol/L熒光素鈉FL溶液和17.07mmol/L AAPH溶液。在96孔板各微孔中分別加入Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品提取液25μL及FL 25μL。在37℃下預(yù)置5 min后加入AAPH 150μL啟動(dòng)反應(yīng),并將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中,在37℃下以激發(fā)波長(zhǎng)485nm、發(fā)射波長(zhǎng)538nm進(jìn)行連續(xù)測(cè)定120min,每2min測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度。樣品抗氧化能力以抗壞血酸當(dāng)量(TEAC)表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)采用3組平行,所得數(shù)據(jù)取平均值,采用SPSS20軟件進(jìn)行單因素方差分析。所有的顯著性分析均在p<0.05水平,利用Origin8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量

從圖1中可以看出,化學(xué)提取組的總酚含量總體要高于體外消化組,并且兩種黑果枸杞的總酚含量高于新疆枸杞。新疆枸杞的化學(xué)提取組與體外消化組的總酚含量分別為7.85、7.76mg GAE/g DW,沒(méi)有顯著差異(p>0.05)。新疆黑枸杞兩組的總酚含量分別為17.26、12.27mg GAE/g DW,后者下降了28.9%。而青海黑枸杞兩組的總酚含量為17.40、14.47mg GAE/g DW,后者下降了16.8%。這說(shuō)明并不是所有的酚類(lèi)物質(zhì)在消化后都能被利用,會(huì)有一部分損失。有研究表明酚類(lèi)物質(zhì)在小腸的堿性環(huán)境下很不穩(wěn)定,有可能會(huì)轉(zhuǎn)化為其他未知的物質(zhì)[11]。

表1 枸杞的化學(xué)提取組和體外消化組中的自由酚酸含量Table 1 Free phenolic acids(FPA)in extracts and digesta of Lycium fruits

圖1 枸杞的化學(xué)提取組和體外消化組中的總酚含量Fig.1 Total phenolic content(TPC) in extracts and digesta of Lycium fruits注：標(biāo)注不同字母表示數(shù)據(jù)有顯著性差異(p<0.05)，表1，圖2～圖6同。

2.2 總花色苷含量

如圖2所示，新疆枸杞中基本未測(cè)出花色苷。相較于化學(xué)提取組(6.07mg/g DW),新疆黑枸杞體外消化組的花色苷(化學(xué)提取組6.07mg/g DW,體外消化組0.17mg/g DW)損失了近97.2%。而青海黑枸杞則是損失了87.1%(化學(xué)提取組5.90mg/g DW,體外消化組0.76mg/g DW)。

從結(jié)果可以看出,與總酚相比,花色苷在消化過(guò)程中的損失更加顯著。這與先前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致:葡萄在腸胃消化后會(huì)損失90%的花色苷[12],而楊梅最高會(huì)損失59.3%[13]。這可能是因?yàn)榛ㄉ赵谥行詐H條件下并不穩(wěn)定,發(fā)生了轉(zhuǎn)化[7]。

圖2 枸杞的化學(xué)提取組和體外消化組中的總花色苷含量 Fig.2 Total anthocyanin content(TAC) in extracts and digesta of Lycium fruits

2.3 酚酸含量

由表1 可知,總體上體外消化后枸杞中的自由酚酸含量較化學(xué)提取高。這說(shuō)明體外消化過(guò)程中的酶解和pH變化更能夠讓酚酸從結(jié)合態(tài)分解為自由態(tài)[14],使得含量高于化學(xué)提取組。與其他兩種枸杞相比,青海黑枸杞的酚酸含量最高(化學(xué)提取組(155.85±5.24)mg/kg DW,體外消化組(186.43±7.50)mg/kg DW),新疆枸杞與新疆黑枸杞則無(wú)顯著差異(p>0.05)。

2.4 不同的抗氧化方法的影響

由于各自的抗氧化反映機(jī)理和適用的實(shí)驗(yàn)范圍不同,四種抗氧化方法的結(jié)果存在略微差異。從圖3～圖6可以看出,DPPH、ABTS和ORAC法中,化學(xué)提取組中新疆黑枸杞的抗氧化性最高,新疆枸杞最低,體外消化組中青海黑枸杞最高,新疆枸杞最低;FRAP法中,化學(xué)提取組和體外消化組均是青海黑枸杞的抗氧化性最高,新疆枸杞最低。同時(shí),除了DPPH法,體外消化組的抗氧化值均低于化學(xué)提取組,有可能是因?yàn)轶w外消化酶解后的酚類(lèi)物質(zhì)含量較低,尤其是花色苷含量大大地降低。

2.5 多酚含量與不同抗氧化方法測(cè)定值的線(xiàn)性相關(guān)性

表2顯示了多酚含量與不同抗氧化值之間的線(xiàn)性關(guān)系?？梢钥闯?化學(xué)提取組中,四種抗氧化方法與TPA、TAC有較高的線(xiàn)性相關(guān)性,而與FPA的相關(guān)性較低。與TPC相比,TAC與DPPH、ABTS和ORAC的線(xiàn)性相關(guān)度更高一些。這結(jié)果跟黑果枸杞中花色苷含量較高有關(guān)?；瘜W(xué)提取組中FPA與抗氧化值的線(xiàn)性相關(guān)性最低。

在體外消化組中,TAC與抗氧化值的線(xiàn)性相關(guān)性(R2>0.90)比TPC(R2>0.86)更高,這說(shuō)明TAC對(duì)樣品抗氧化性的貢獻(xiàn)更大。同時(shí),與化學(xué)提取組結(jié)果(R2>0.03)不同的是,FPA與抗氧化值的線(xiàn)性相關(guān)性(R2>0.68)要高很多。

表2 多酚含量與不同抗氧化方法測(cè)定值的線(xiàn)性相關(guān)性Table 2 Coefficient of determination(R2)between antioxidant activity values and the phenolic profiles(TPC.TAC and FPA)

圖3 DPPH法測(cè)定枸杞中化學(xué)提取組 和體外消化組的抗氧化性Fig.3 Antioxidant activity determined by ABTS assays of three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

圖4 FRAP法測(cè)定枸杞中化學(xué)提取組 和體外消化組的抗氧化性Fig.4 Antioxidant activity determined by FRAP assays of f three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

圖5 ABTS法測(cè)定枸杞中化學(xué)提取組 和體外消化組的抗氧化性Fig.5 Antioxidant activity determined by ABTS assays of three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

圖6 ORAC法測(cè)定枸杞中化學(xué)提取組 和體外消化組的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activity determined by ORAC assays of three cultivars of Lycium fruits after chemical extraction or in vitro digestion

3 結(jié)論

目前對(duì)于黑果枸杞的生物活性研究,包括黃酮、色素、酚酸等,均采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法,但此種方法測(cè)定的活性成分含量與人體消化吸收的含量之間存在著較大的差異,不足以準(zhǔn)確反映其實(shí)際營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,因此本文首次采用了體外消化法對(duì)黑果枸杞的多酚成分含量和抗氧化性進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)與化學(xué)提取法相比,體外消化法提取的總酚和總花色苷含量較低,而酚酸含量則更高。這說(shuō)明在體外消化過(guò)程中,不同的多酚物質(zhì)在pH和酶的作用下發(fā)生了不同的變化。此外,總酚和總花色苷與各化學(xué)抗氧化值均有較高的線(xiàn)性相關(guān)性,而酚酸與各化學(xué)抗氧化值的相關(guān)性較低,顯示出總酚和總花色苷對(duì)黑果枸杞抗氧化性的貢獻(xiàn)更大。體外消化法主要是用消化酶處理樣品,通過(guò)不同的pH變化模擬人體消化環(huán)境,其測(cè)定值比化學(xué)提取法更具有生物相關(guān)性。但為了能深入分析黑果枸杞的多酚物質(zhì)在人體中的生物利用率,還需要利用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型來(lái)做進(jìn)一步的研究。

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Research of bioavailability and antioxidant activity of polyphenol inLyciumruthenicumMurr

LOU Shu-ting1,LIN Wen-wen1,SUN Yu-jing2,LI Xin1,PAN Jun-xian1,YE Xing-qian1,3,*

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China；2. Department of Food Science and Technology,Ocean College,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China;3. Fu Li Food Research Institute,Hangzhou,310058，China)

The effect of chemical extraction(i.e.,extracts)andinvitrodigestion(i.e.,digesta)method on the polyphenol content ofLyciumruthenicumMurr was investigated in this paper. Four different methods including DPPH,FRAP,ABTS,and ORAC were used to measure its antioxidant activity. The results showed that digesta had more free phenolic acids(FPA),but less total phenolic content(TPC)and total anthocyanin content(TAC)than extracts. The antioxidant activity of the extracts was higher than digesta. The correlations were high between TPC,TAC and chemical antioxidant activity(R2>0.83). FPA were better correlated with the chemical antioxidant assays in digesta(R2>0.68)than extracts(R2>0.03).

LyciumruthenicumMurr.;phenolics;invitrodigestion;antioxidant activity

2014-08-20

樓舒婷(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：黑果枸杞的生物活性研究。

*通訊作者:葉興乾(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工與工程。

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2012BAD31B06)；浙江省重大專(zhuān)項(xiàng)(2011C160444)；浙江省科技團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2010R50032)；植物食品加工技術(shù)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2010R50032)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)11-0066-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.005