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    T輔助淋巴細(xì)胞的功能變化在急性肺損傷中的意義研究

    2015-05-05 01:30:38林明楊自力
    中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新 2015年25期
    關(guān)鍵詞:抗炎淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子

    林明 楊自力

    目前認(rèn)為,促炎與抗炎反應(yīng)失衡為誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的根本原因,但目前對(duì)促炎與抗炎反應(yīng)失衡準(zhǔn)確評(píng)估有較大難度。大量研究表明,T輔助淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的免疫功能狀態(tài),其功能變化在急性肺損中的作用較大[1]。為了探討T輔助淋巴細(xì)胞的功能變化在急性肺損傷中的意義,本文選取100只小鼠作為研究對(duì)象進(jìn)行分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)小鼠均為野生鼷鼠的變種,來源于野生的小家鼠,選取100只小鼠作為研究對(duì)象。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分成觀察組和對(duì)照組,每組50只,雌雄各半,體重20~24 g。兩組小鼠的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2 方法

    1.2.1 小鼠處理 首先為觀察組小鼠進(jìn)行適量脂多糖(LPS)的注射,其注射的部位主要在小鼠腹腔處,7.5 h之后再為小鼠注射適量的甲?;?苯丙氨酸,然后進(jìn)行急性肺損傷小鼠基本模型的制作,等到大約3.5 h之后將小鼠處死;對(duì)照組小鼠則進(jìn)行適量生理鹽水的簡單注射,注射的量和觀察組小鼠藥物注射量相同。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在對(duì)小鼠進(jìn)行有效處理之后,按照相關(guān)要求進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞的正常分離,適量增添細(xì)胞培養(yǎng)液,利用顯微鏡觀察小鼠脾細(xì)胞的數(shù)量,然后對(duì)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行稀釋處理,最終使其量控制在10×106個(gè)左右,加入適量的刀豆素,使其濃度控制在1.1 μg/mL左右,溫室溫度下及4.5%濃度的二氧化碳的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間在70 h左右,培養(yǎng)結(jié)束之后,留取細(xì)胞上清液,檢測上清液中的IFN-γ濃度及IL-4濃度,最后提取脾細(xì)胞中的RNA。

    1.2.3 濃度測定 在檢測細(xì)胞當(dāng)中的相關(guān)因子濃度時(shí),需要用到IFN-γ酶的專門吸附盒和IL-4酶的專門吸附盒,按照吸附盒上面的具體要求進(jìn)行細(xì)胞測定,利用酶標(biāo)儀對(duì)波長500 nm的位置進(jìn)行密度檢測,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化規(guī)律,最終確定小鼠細(xì)胞當(dāng)中的具體因子濃度。

    1.2.4 基因表達(dá)數(shù)量計(jì)算 利用PCR的標(biāo)準(zhǔn)測定試劑盒,進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞當(dāng)中的基因轉(zhuǎn)錄,使其最終合成cDNA,然后進(jìn)行PCR的有效擴(kuò)增。對(duì)引物序列進(jìn)行正常排序,主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物,它們分別有各自的上游引物和下游引物。經(jīng)過對(duì)引物圖像的觀察和分析進(jìn)行產(chǎn)物測量,對(duì)三大序列產(chǎn)物進(jìn)行正常掃描,確定出具體的光密度數(shù)值,最后進(jìn)行三大序列引物光密度數(shù)值的相互對(duì)比,從而測得基因表達(dá)。

    1.2.5 損傷指標(biāo)檢測 首先進(jìn)行肺組織含水量的正常檢測,在處死小鼠以后,把小鼠的右肺進(jìn)行有效割除,進(jìn)行表面水清除之后進(jìn)行肺組織稱重,稱重之后放到專門烘箱當(dāng)中進(jìn)行有效烘干后稱重;然后進(jìn)行漏出量的具體檢測,在小鼠腹腔當(dāng)中進(jìn)行藥物注射,處死小鼠之后利用專用針進(jìn)行小鼠右心室的有效穿刺,利用適當(dāng)濃度的生理鹽水進(jìn)行小鼠肺部的清洗,使其完全干凈,切除小鼠的肺部相關(guān)組織,對(duì)肺門組織進(jìn)行正常稱重,進(jìn)行小鼠肺組織的孵育,孵育的時(shí)候要添加適量的甲酰胺,收集其浸出的液體,進(jìn)行液體吸光值的具體有效計(jì)算。對(duì)照組小鼠確定伊文思藍(lán)的具體濃度值;最后進(jìn)行小鼠肺組織的有效觀察,進(jìn)行肺下葉的正常染色,觀察其病理變化情況,利用相關(guān)分析軟件確定出細(xì)胞PMN的平均值。

    1.3 觀察項(xiàng)目和指標(biāo) (1)小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量;(2)脾細(xì)胞中IFN-γ的基因表達(dá)能力[2]。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(±s)表示,比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    觀察組小鼠上清液中IFN-γ的含量明顯低于對(duì)照組,IL-4含量明顯高于對(duì)照組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),觀察組小鼠體內(nèi)脾細(xì)胞中IFN-γ基因表達(dá)能力明顯低于對(duì)照組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 兩組IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ基因表達(dá)能力比較(x-±s)

    3 討論

    急性肺損傷是一種各種致病因素引發(fā)的廣泛肺泡毛細(xì)血管損傷,以致炎因子釋放、中性粒細(xì)胞浸潤、廣泛肺泡毛細(xì)血管損傷為特征,臨床以難以糾正的低氧血癥及進(jìn)行性呼吸困難為主要表現(xiàn),急性嚴(yán)重肺損傷,在臨床被定義為急性呼吸窘迫綜合征[3]。如何對(duì)肺損傷過程中肺泡受損毛細(xì)血管保護(hù)并修復(fù),是肺保護(hù)的重點(diǎn)。ALI的發(fā)生發(fā)展,由機(jī)體過度炎癥反應(yīng)參與介導(dǎo)[4]。危重病醫(yī)學(xué)會(huì)在2001年將機(jī)體過度炎癥反應(yīng)定義為全身炎癥反應(yīng)綜合征,其后果為破壞機(jī)體自身組織。機(jī)體內(nèi)源性抗炎癥反應(yīng)伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生,呈增強(qiáng)趨勢[5]。Bone等[6]將此種抗炎癥反應(yīng)按抗炎癥反應(yīng)綜合征概括,其引發(fā)的后果是膿毒癥及免疫功能低下,故不管哪方占優(yōu)勢,ALI病發(fā)中,促炎及抗炎反應(yīng)失衡均為本質(zhì)原因。故針對(duì)檢測的促炎、抗炎反應(yīng)失衡的程度和方向,應(yīng)用不同的措施干預(yù),使雙方動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù),是對(duì)ALI防治的關(guān)鍵。但對(duì)促炎、抗炎雙方平衡的相關(guān)性評(píng)價(jià),目前臨床尚無有效評(píng)估指標(biāo)。有研究顯示,Th細(xì)胞,可反映雙方平衡關(guān)系,Th1細(xì)胞以對(duì)促炎細(xì)胞因子分泌為特征,與促炎反應(yīng)有密切相關(guān)性;Th2細(xì)胞以對(duì)抗炎細(xì)胞因子分泌為特征,與抗炎反應(yīng)有密切相關(guān)性[7-9]。IFN-γ、IL-4為特征性細(xì)胞因子,分別由Th1、Th2細(xì)胞分泌,二者平衡,可反映促炎和抗炎的平衡情況。

    有研究示,取LPS、FNLP經(jīng)腹腔注射后,肺濕重與干重比、肺伊文斯藍(lán)浸出量、肺病理改變均提示成功建立ALI模型[10]。對(duì)脾細(xì)胞中IL-4、IFN-γ變化進(jìn)行觀察,結(jié)果相較對(duì)照組,BLAB/C小鼠在ALI時(shí),脾細(xì)胞中IFN-γ呈近60%的下降,而檢測IL-4,呈4倍多的升高。此與蔣雄斌等[10]報(bào)道一致,但I(xiàn)L-4升高更為明顯。

    IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡變化的典型細(xì)胞因子,此種變化表明,在ALI發(fā)生時(shí),Th1漂移至Th2。目前研究顯示,Th1飄移至Th2,與下列因素可能相關(guān)。(1)LPS結(jié)合單核巨噬細(xì)胞表面CD14受體,對(duì)TNFα、IL-1等炎癥細(xì)胞因子釋放,同時(shí)伴隨大量抑制介質(zhì)前列腺素E2的釋放,經(jīng)PGF2依賴性通道,促使Th細(xì)胞向Th2表型明確轉(zhuǎn)化。PGE2可對(duì)Th1合成IFN-γ、IL-2明顯抑制,卻對(duì)Th2生成IL-4不影響[11]。(2)與炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1、TNF-α的釋放伴發(fā),糖皮質(zhì)激素有增加表現(xiàn),糖皮質(zhì)激素可對(duì)Th1細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄抑制因子合成增加產(chǎn)生刺激,此因子與核因子結(jié)合,促使復(fù)合物形成,從而對(duì)炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄阻止[12]。此外,糖皮質(zhì)激素,可影響炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

    對(duì)脾細(xì)胞中的IFN-γmRNA表達(dá)進(jìn)一步觀察得出,ALI時(shí)IFN-γmRNA表達(dá)下降明顯,IL-4m RNA表達(dá)量顯著升高。提示ALI時(shí),可在mRNA水平上使促炎細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)抑制,抗炎細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)增加,從而引發(fā)促炎、抗炎失衡。

    Th1向Th2飄移,表明抗炎癥反應(yīng)在ALI發(fā)生時(shí),呈增強(qiáng)趨勢,而抗炎癥反應(yīng)的增強(qiáng),誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)低下。故可通過對(duì)Th1、Th2平衡變化檢測,選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī),針對(duì)免疫功能低下,采

    取有效的免疫調(diào)節(jié)措施,使促炎、抗炎平衡恢復(fù),對(duì)ALI進(jìn)行防治。促炎與抗炎反應(yīng)失衡,為誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的本質(zhì)原因,對(duì)促炎與抗炎反應(yīng)失衡準(zhǔn)確評(píng)估有較大難度[13]。T輔助淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的免疫功能狀態(tài)。

    在受到嚴(yán)重的創(chuàng)傷之后,傷口是容易感染的,而在感染之后,傷口處容易出現(xiàn)各種病毒和細(xì)菌,會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人們的身體健康。相關(guān)研究結(jié)果證明,急性肺損傷與體內(nèi)炎癥反應(yīng)不平衡相關(guān),會(huì)導(dǎo)致機(jī)體促炎、抗炎反應(yīng)不平衡[14]。機(jī)體內(nèi)各類脾細(xì)胞當(dāng)中,存在很多促炎細(xì)胞和抗炎細(xì)胞,比如干擾素和白介素等,只有保證這兩種因子平衡,才能保證兩種細(xì)胞平衡[15]。當(dāng)發(fā)生急性肺損傷,機(jī)體炎癥反應(yīng)規(guī)律是不明確的,各種細(xì)胞的反應(yīng)情況也是不明確的,本文主要通過對(duì)急性肺損傷小鼠的功能試驗(yàn)研究,反應(yīng)急性肺損傷機(jī)體炎癥反應(yīng)情況。

    相關(guān)研究結(jié)果表明,在急性肺損傷研究當(dāng)中,觀察機(jī)體炎癥反應(yīng)是比較重要的,因?yàn)樵诜螕p傷的過程中,會(huì)產(chǎn)生傷口感染從而引起傷口炎癥出現(xiàn)[16]。因此,通過肺損傷相關(guān)部位抗炎反應(yīng)及能力的檢測和觀察,就可以判斷急性肺損傷病情。本文主要通過小鼠淋巴細(xì)胞試驗(yàn),對(duì)小鼠急性肺損傷的相關(guān)平衡因子和基因表達(dá)功能進(jìn)行檢測,最終發(fā)現(xiàn),機(jī)體抗炎反應(yīng)在急性肺損傷中的作用非常大,而T輔助淋巴細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)這種抗炎反應(yīng)的調(diào)節(jié)和控制作用也比較大,在急性肺損傷疾病臨床研究中的意義比較大。急性肺損傷機(jī)體抗炎反應(yīng)主要表現(xiàn)為單核細(xì)胞的有效受體結(jié)合、抗炎因子的生成和細(xì)胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4兩大因子的有效合成和轉(zhuǎn)化、IL-10因子的生成和增加、糖皮質(zhì)激素的不斷增加及脾細(xì)胞因子的異常轉(zhuǎn)錄等[17]。經(jīng)過對(duì)小鼠體內(nèi)T輔助淋巴細(xì)胞功能變化的有效觀察可以判斷急性肺損傷小鼠的病理學(xué)變化情況,急性肺損傷小鼠脾細(xì)胞mRNA表達(dá)能力比正常小鼠弱很多,證明抗炎反應(yīng)是導(dǎo)致急性肺損傷的主要原因。

    本研究結(jié)果表明觀察組小鼠上清液當(dāng)中IFN-γ的含量明顯比對(duì)照組低,IL-4含量卻比對(duì)照組高,且經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄測定結(jié)果顯示,觀察組小鼠體內(nèi)脾細(xì)胞IFN-γ基因表達(dá)能力明顯比對(duì)照組低,以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明當(dāng)發(fā)生急性肺損傷后,小鼠會(huì)產(chǎn)生明顯的抗炎癥反應(yīng),T輔助淋巴細(xì)胞的功能變化在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用比較大。

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