白楊素含膦（磷）衍生物對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用

扶云碧 劉志和 彭愛云

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中，是藥用植物中的主要活性成分之一，亦是人類飲食中的重要組成部分。黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用尤其是抗腫瘤作用引人矚目[1-3]。近年來世界上掀起了黃酮類化合物開發(fā)的熱潮。白楊素（chrysin）是被廣泛研究的黃酮類化合物之一，其來源于紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂膠中的含量較高，是蜂膠的主要有效成分。白楊素的化學(xué)名為5，7-二羥基黃酮。研究證明，白楊素具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗高血壓、抗糖尿病、抗菌、抗過敏等多種藥理作用[4]。本研究旨在探討新合成的一類膦（磷）?；讞钏匮苌镌隗w外對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Kasumi-1細(xì)胞株、K562細(xì)胞株、HL60細(xì)胞株、Jurkat細(xì)胞株、NB4細(xì)胞株及U937細(xì)胞株購中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，白楊素含膦（磷）衍生物由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院彭愛云提供。PRMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，新生牛血清從杭州四季青生物工程材料有限公司購買，甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司。

1.2 白楊素含膦（磷）衍生物的合成 以白楊素為先導(dǎo)化合物，按步驟1和步驟2所示的合成路線（圖1），經(jīng)膦（磷）酰化結(jié)構(gòu)修飾后合成新的系列白楊素含膦（磷）衍生物。結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、紅外、質(zhì)譜等確證，純度經(jīng)高效液相色譜鑒定?；衔锖铣捎芍猩酱髮W(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及原代細(xì)胞分離 細(xì)胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，加1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素，在37 ℃、95%飽和濕度和5% CO2條件下培養(yǎng)，1~2 d換液1次。

選取根據(jù)MIC分型診斷為急性白血病的初診患者，抽取骨髓5 mL，分離單個(gè)核細(xì)胞（BMMNCs）。共分離10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 取指數(shù)生長期細(xì)胞或BMMNCs，實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（2×104個(gè)細(xì)胞），100 μL用培養(yǎng)基稀釋的藥物。白楊素為陽性對(duì)照組、設(shè)溶媒對(duì)照組及調(diào)零組，每組3孔，培養(yǎng)一定時(shí)間后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），調(diào)零組加入無血清PRMI-1640培養(yǎng)基，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶標(biāo)儀以450 nm波長測(cè)定OD值，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

圖1 白楊素含膦（磷）衍生物的合成

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素含膦（磷）衍生物的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 合成了12個(gè)白楊素膦酸單酯（3a–3l），6個(gè)白楊素膦酸（4a–4f），1個(gè)白楊素膦（磷）酸6和2個(gè)白楊素膦（磷）酸單酯7a，7b，共21個(gè)化合物。結(jié)構(gòu)見圖2。該類化合物是未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物，其構(gòu)效關(guān)系顯示有更強(qiáng)的抗腫瘤活性、較好的水溶性、更高的生物利用度，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、紅外、質(zhì)譜等確證，純度經(jīng)高效液相色譜鑒定，均達(dá)到99.5%以上，溶解度經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定為52.3-138.6 μm。

圖2 白楊素含膦（磷）衍生物

2.2 白楊素含膦（磷）衍生物對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖抑制活性篩選 為了篩選出增殖抑制活性較強(qiáng)的化合物，參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道先導(dǎo)化合物——白楊素抑制細(xì)胞活性的有效濃度，并以其作為陽性對(duì)照，12個(gè)化合物分別以100 μm作用細(xì)胞48 h，MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果見表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b對(duì)Kasumi-1細(xì)胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b對(duì)細(xì)胞的抑制活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于先導(dǎo)化合物白楊素，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

表1 白楊素膦（磷）酸衍生物對(duì)Kasumi-1細(xì)胞的增殖抑制率

以白楊素（chrysin）為對(duì)照，100 μm的3c、7a分別作用Kasumi-1細(xì)胞 0、12、24、36、48、60 h，結(jié)果見圖 3。100 μm的3c作用36 h細(xì)胞活性最低，100 μm的7a作用48 h細(xì)胞活性最低。衍生物3c、7a對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖抑制活性呈時(shí)間依賴性，且均強(qiáng)于白楊素，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。0、25、50、75、100 μm 的 3c、7a 分別作用Kasumi-1細(xì)胞48 h，結(jié)果見圖4。衍生物3c在50 μm濃度時(shí)，細(xì)胞活性達(dá)到最低，衍生物7a在100 μm濃度時(shí)，細(xì)胞活性最低。衍生物3c、7a對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖抑制活性呈濃度依賴性，且均強(qiáng)于白楊素，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖抑制的時(shí)效關(guān)系及量效關(guān)系見圖3和圖4。

圖3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖抑制的時(shí)效關(guān)系曲線

圖4 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖抑制的量效關(guān)系曲線

2.3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對(duì)多個(gè)白血病細(xì)胞株的增殖抑制活性 為了探討衍生物3c、7a對(duì)其他白血病細(xì)胞株的活性，選用衍生物3c、7a對(duì)Kasumi-1細(xì)胞株有效作用時(shí)間及濃度，分別作用于Jurkat細(xì)胞株、NB4細(xì)胞株、K562細(xì)胞株、HL60細(xì)胞株及U937細(xì)胞株，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果見圖5、圖6。衍生物3c、7a對(duì)以上細(xì)胞株的增殖均有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間及濃度依賴性。與對(duì)照組比較，作用時(shí)間48 h時(shí)，25 μm衍生物3c即對(duì)U937細(xì)胞產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用；50 μm濃度時(shí)對(duì)Jurkat細(xì)胞株、NB4細(xì)胞株、K562細(xì)胞株及HL60細(xì)胞株有明顯的增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從時(shí)效關(guān)系方面看，與對(duì)照組比較，100 μm的3c作用24 h后，對(duì)U937細(xì)胞株及Jurkat細(xì)胞株有明顯的增殖抑制作用；作用36 h后對(duì)NB4細(xì)胞株、K562細(xì)胞株及HL60細(xì)胞株有明顯的增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同濃度的衍生物7a作用各細(xì)胞株48 h，25 μm濃度時(shí)對(duì)HL60細(xì)胞及U937細(xì)胞即有明顯增殖抑制效果，比較對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；50 μm濃度時(shí)K562細(xì)胞及NB4細(xì)胞有顯著增殖抑制效果，比較對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而Jurkat細(xì)胞則在75 μm時(shí)出現(xiàn)明顯增殖抑制作用。100 μm的7a作用各細(xì)胞株時(shí)效關(guān)系曲線顯示，作用24 h，NB4細(xì)胞即出現(xiàn)一定的增殖抑制效果，比較對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；作用36 h，除U937細(xì)胞外，其余細(xì)胞均出現(xiàn)顯著增殖抑制作用，比較對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；U937細(xì)胞出現(xiàn)一定程度增殖抑制作用，但與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；U937細(xì)胞在48 h后出現(xiàn)顯著增殖抑制作用，比較對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對(duì)AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初診的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急變1例，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用不同濃度的白楊素含膦（磷）衍生物3c或7a處理48 h，取10例患者各濃度的OD值平均數(shù)做曲線，結(jié)果見圖7。與細(xì)胞株結(jié)果類似，衍生物3c及7a對(duì)急性白血病患者的骨髓原代細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，且為濃度依賴性。

3 討論

許多研究者對(duì)從植物中篩選出的天然黃酮類化合物（如葛根總黃酮、姜黃素、金蓮花黃酮、染料木黃酮等）進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外對(duì)多種白血病細(xì)胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黃酮存在活性偏低、類藥性差等缺點(diǎn)。為了提高其抗腫瘤活性，適應(yīng)臨床應(yīng)用，各種各樣的黃酮衍生物被合成[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道最成熟的為國外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黃酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗(yàn)已證實(shí)此藥單用或與其他化療藥物合用對(duì)難治復(fù)發(fā)性急性或慢性白血病均有肯定療效[6，10]。

圖5 白楊素含膦（磷）衍生物3c對(duì)各細(xì)胞株的增殖抑制活性

圖6 白楊素含膦（磷）衍生物7a對(duì)各細(xì)胞株的增殖抑制活性

圖7 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對(duì)AML患者BMMNCs的增殖抑制作用

近年來許多國內(nèi)外學(xué)者對(duì)白楊素衍生物的合成方法和生理活性進(jìn)行了研究，對(duì)白楊素進(jìn)行硝化、烷基化、羥甲基化、氟甲基化、膦（磷）?；蠛铣傻牟糠盅苌锞哂休^強(qiáng)的抗腫瘤活性，在體外對(duì)許多腫瘤細(xì)胞都有明顯的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 細(xì)胞、人肺癌A549 細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞及HepB3細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞、人結(jié)腸癌（HT-29）細(xì)胞、人類小細(xì)胞肺癌NCI2H446細(xì)胞、人急性粒細(xì)胞性白血病HL-60細(xì)胞、人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat 細(xì)胞、急性白血?。∕5）U937細(xì)胞等[5，11-13]。白楊素膦（磷）?；Y(jié)構(gòu)修飾的報(bào)道較少，陳曉嵐等[14]對(duì)白楊素進(jìn)行了含膦（磷）改造，共合成出4種新的化合物，他們的研究結(jié)果表明，白楊素含膦（磷）衍生物與溶菌酶具有更強(qiáng)的親和力。張婷等[15]合成了白楊素四乙基二膦（磷）酸酯，并發(fā)現(xiàn)白楊素和白楊素四乙基二膦（磷）酸酯對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞軟瓊脂的集落形成有明顯抑制作用，能誘導(dǎo)并促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生分化，且白楊素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面較白楊素明顯，該研究提示膦（磷）酸基團(tuán)的添加增強(qiáng)了抗腫瘤活性。

筆者通過化學(xué)法，將膦酸或膦（磷）酸基團(tuán)引入到白楊素側(cè)鏈中，新合成21個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的白楊素含膦（磷）衍生物。這些白楊素含膦（磷）衍生物具備以下優(yōu)點(diǎn)：（1）它們較白楊素具有更好的水溶性。預(yù)期在體內(nèi)能較好的被吸收，可以彌補(bǔ)大多數(shù)天然黃酮因水溶性較差而導(dǎo)致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基團(tuán)是一些抗骨質(zhì)疏松、抗病毒、抗腫瘤等藥物分子的藥效團(tuán)，白楊素又具有廣泛生物活性，所合成的白楊素含膦（磷）衍生物應(yīng)用了藥效團(tuán)拼合原理，可能具有更好的藥理活性。通過體外細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，從新合成的白楊素含膦（磷）衍生物中篩選出對(duì)急性白血病（M2）細(xì)胞株Kasumi-1增殖抑制作用較強(qiáng)的2個(gè)衍生物（3c、7a），這兩個(gè)化合物100 μm濃度作用48 h對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制率分別為82.64%、79.23%，白楊素同等條件下對(duì)白血病細(xì)胞的抑制率為47.39%。此后，用衍生物3c及7a分別處理多個(gè)細(xì)胞株及急性白血病患者的骨髓原代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，白楊素含膦（磷）衍生物3c及7a對(duì)檢測(cè)的多個(gè)白血病細(xì)胞株及患者骨髓原代細(xì)胞均有明顯的增值抑制作用，說明該兩個(gè)衍生物有體外抗白血病活性，有進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性研究的價(jià)值。

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