STR試劑盒在快速數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中的應(yīng)用

劉亞舉，張俊濤，金海英

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·法醫(yī)學(xué)·

STR試劑盒在快速數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中的應(yīng)用

Application of Direct and Rapid PCR Amplification Kit of STR in DNA Database

劉亞舉1，張俊濤2，金海英3

目的 評(píng)價(jià)STRtyper-21G Plus試劑盒在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中的應(yīng)用。方法 針對(duì)各種紙質(zhì)血樣本特性，優(yōu)化擴(kuò)增體系和引物量、樣本的取樣量及循環(huán)次數(shù)，縮短PCR擴(kuò)增時(shí)間，以建立適合批量樣本直接快速擴(kuò)增檢驗(yàn)的方法，將其應(yīng)用于2 000份數(shù)據(jù)庫(kù)樣本的檢驗(yàn)中，并與PowerPlex?21試劑盒進(jìn)行比較。結(jié)果 采用10 μL擴(kuò)增體系時(shí)，得到了STRtyper-21G Plus試劑盒批量樣本檢驗(yàn)的最適取樣量和擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，建立了快速擴(kuò)增反應(yīng)程序，2 000份樣本的直接快速擴(kuò)增檢驗(yàn)成功率為98.7%，批量檢驗(yàn)92份樣本(1個(gè)96孔板) 從取樣到電泳結(jié)束只需5 h；PowerPlex?21試劑盒分別為98.1%和6 h。結(jié)論 STRtyper-21G Plus試劑盒的應(yīng)用，省去樣本DNA提取過(guò)程，操作方法簡(jiǎn)單、快速，獲得信息量大，適用于DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)的需要。

法醫(yī)物證學(xué)；直接快速擴(kuò)增法；STRtyper-21G Plus試劑盒；DNA數(shù)據(jù)庫(kù)

在眾多STR基因座中，以突變率低、多態(tài)性較好、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)的基因座在法醫(yī)DNA分析中被優(yōu)先采用，其中遺傳多態(tài)性要滿足DP>0.9、H>0.7[1]。作者對(duì)河南漢族50余個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性進(jìn)行了調(diào)查[2-4]，在銜接法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，篩選了適合DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)應(yīng)用的STR基因座。本文主要探討這些STR基因座所建立的直接復(fù)合擴(kuò)增體系在快速數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣本 本實(shí)驗(yàn)室建庫(kù)血樣2 000份。其中FTA卡樣本500份、普通濾紙樣本500份、公安部物證鑒定中心研制的采集卡樣本500份、武漢驥騰公司研制的采集卡樣本500份。

1.2 主要試劑與儀器 BSD-QP型打孔機(jī)(BSD公司，澳大利亞)；Hamilton STAR-LET自動(dòng)化工作站(AusBio公司，瑞士)；9700型PCR擴(kuò)增儀和3500XL型遺傳分析儀、ID-X分析軟件(AB公司，美國(guó))；GeneMarker?HID分析軟件(SoftGenetics公司，美國(guó))；IDproof分析軟件(Qiagen公司，德國(guó))。STRtyper-21G Plus試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司)和PowerPlex?21試劑盒(Promega公司，美國(guó))。

1.3 優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件 擴(kuò)增體系和引物量：采用5、10、25 μL擴(kuò)增體系和2×、4×、10×引物量對(duì)1 ng 9947A標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行檢驗(yàn)并重復(fù)1次。不同紙質(zhì)載體的取樣量及循環(huán)次數(shù)：隨機(jī)抽取FTA血卡、血濾紙、公安血液采集卡、武漢血液采集卡樣本各100份，各樣本按直徑0.5 mm和1.0 mm分別取樣。采用10 μL PCR反應(yīng)體系，其中Master Mix(包含TritonX-100、Mg2+、dNTP、Betaine、Tween20和HS-Taq聚合酶)5.0 μL，Primer Set 2.5 μL，純水2.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min；94℃ 20 s，61℃ 1 min，70℃ 1 min；60℃ 30 min；4℃保溫；循環(huán)次數(shù)設(shè)置為24、26、28、30、32 次?？焖贁U(kuò)增體系及程序：優(yōu)化Master Mix配制，按照上述體系用量配比PCR反應(yīng)液，同時(shí)改變變性、退火、延伸時(shí)間，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序見(jiàn)表1。

表1 快速PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

1.4 批量樣本的取樣與快速擴(kuò)增 2 000份樣本，按照前述方法取樣，96孔板樣品孔中待測(cè)樣本92份，設(shè)置陰性和陽(yáng)性，H6、F12孔空置( 用于電泳時(shí)加Ladder)，按照表1程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2 000份樣本，按照PowerPlex?21試劑盒說(shuō)明書打取血樣和進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 電泳檢測(cè)與分型分析 取1.0 μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5 μL內(nèi)標(biāo)和8.5 μL去離子甲酰胺混合；H6和F12孔內(nèi)加入Ladder 1.0 μL。置3500XL型遺傳分析儀上全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，結(jié)果用GeneMarker?HID或IDproof分析軟件進(jìn)行等位基因分型，并采用GeneMapperID-X分析軟件復(fù)核分析。全部基因座檢出STR分型界定為成功。

2 結(jié)果

2.1 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 擴(kuò)增體系 應(yīng)用不同體系進(jìn)行擴(kuò)增，分型結(jié)果一致，未出現(xiàn)等位基因丟失和非特異峰等情況，部分基因座出現(xiàn)的stutter峰均在主峰的10%以下，空白對(duì)照樣本正常。隨著擴(kuò)增體積減小，峰值(rfu) 有增強(qiáng)的趨勢(shì)，5 μL體系在2 000～20 000之間，10 μL體系在2 500～10 000之間；25 μL體系在700～6 000之間(圖1)。比較顯示，在標(biāo)準(zhǔn)體系(10 μL)下，獲得的圖譜均衡性最好。

圖1 不同擴(kuò)增體系檢測(cè)結(jié)果

圖2 不同引物量檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 引物量 應(yīng)用不同引物量進(jìn)行擴(kuò)增，分型結(jié)果一致，未出現(xiàn)等位基因丟失的現(xiàn)象。峰值(rfu)范圍，2×引物量在200～3 000之間，4×引物用量在600～10 000之間，10×引物用量在1 0000～3 0000之間。分型圖譜均未出現(xiàn)非特異峰，部分基因座出現(xiàn)的stutter峰均在主峰的10%以下(圖2)。比較顯示，4×引物量條件下，平均峰值最高。

2.2 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化后的結(jié)果

2.2.1 取樣量 FTA血卡取樣直徑為1.0 mm時(shí)，出現(xiàn)大片段丟失等情況，獲得完整分型的成功率較低；取樣直徑為0.5 mm時(shí)，檢出(全部基因型)成功率為98.2%。血濾紙、公安血液采集卡和武漢血液采集卡取樣直徑為1.0 mm時(shí)，檢出(全部基因型)成功率為99.6%；取樣直徑為0.5 mm時(shí)，大部分樣本出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象。因此，使用10 μL擴(kuò)增體系時(shí)，F(xiàn)TA血卡取樣直徑應(yīng)為0.5 mm，而血濾紙、公安血液采集卡和武漢血液采集卡取樣直徑應(yīng)為1.0 mm。

2.2.2 循環(huán)次數(shù) 隨擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的遞增，熒光檢測(cè)信號(hào)逐漸增強(qiáng)。循環(huán)24、26次，熒光信號(hào)檢測(cè)均值較低，部分基因座在100 rfu以下，且部分基因座擴(kuò)增不完全；循環(huán)28、30、32次，擴(kuò)增均得到分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的情況，峰值(rfu)分別為700～5 000、1 000～12 000、3 000～30 000，部分基因座出現(xiàn)的stutter峰均在主峰的10% 以下(圖3) 。由于循環(huán)30次以上時(shí)產(chǎn)物量較大，容易產(chǎn)生滲透峰，最終確定樣本質(zhì)量較好時(shí)，采用27或28次循環(huán)，樣本質(zhì)量較差時(shí)，可增加循環(huán)參數(shù)至29或30 次。

圖3 不同循環(huán)次數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 快速擴(kuò)增檢驗(yàn) 應(yīng)用快速擴(kuò)增反應(yīng)獲得的STR分型結(jié)果，峰值(rfu)均值在800～10 000之間，各基因座擴(kuò)增結(jié)果均衡性較好，無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增(圖4)。兩步法和三步法快速擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)29次其峰值(rfu)均值在1 000～20 000之間(圖5)。

圖4 快速擴(kuò)增反應(yīng)程序建立前后的電泳圖譜

圖5 快速擴(kuò)增反應(yīng)程序兩步法和三步法的電泳圖譜

2.3 批量樣本檢驗(yàn)結(jié)果 使用STRtyper-21G Plus試劑盒，采用本文優(yōu)化方法進(jìn)行快速擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果均獲得了良好的分型結(jié)果，并與PowerPlex?21試劑盒分型一致，其一次檢出成功率為98.7%，批量檢驗(yàn)92份樣本(1個(gè)96孔板) 從取樣到電泳結(jié)束只需5 h；而PowerPlex?21試劑盒分別為98.1%和6 h。由于allelic ladder以外的等位基因都必須進(jìn)行人工識(shí)別，表2為兩個(gè)試劑盒基因座allelic ladder及bin的數(shù)量。STRtyper-21G Plus試劑盒在有些基因座會(huì)標(biāo)注為off-ladder(OL)，而PowerPlex?21試劑盒自動(dòng)標(biāo)注等位基因(圖6)。

表2 兩個(gè)試劑盒allelic ladder及bin數(shù)量

圖6 D21S11基因座在兩個(gè)試劑盒中的標(biāo)注

3 討論

STRtyper-21G Plus試劑盒和PowerPlex?21試劑盒一樣，包含21個(gè)基因座(20個(gè)STR基因座和1個(gè)Amelogenin性別基因)，20個(gè)STR基因座[2-3]累積個(gè)體識(shí)別率(CDP)為1-7.6841×10-25，二聯(lián)體累積非父排除率(CPEduo)為1-4.2719×10-6，三聯(lián)體累積非父排除率(CPEtrio)為1～2.1079×10-9，與GlobalFiler試劑盒全部21個(gè)STR基因座的遺傳學(xué)參數(shù)相當(dāng)[3]，滿足法醫(yī)DNA檢驗(yàn)要求。同時(shí)，STRtyper-21G Plus試劑盒可直接擴(kuò)增各種紙質(zhì)載體樣本，不僅省去DNA提取環(huán)節(jié)，而且可以有效防止污染，使操作更為簡(jiǎn)單?？芍苯訑U(kuò)增檢驗(yàn)與以下因素有關(guān)：①Buffer中包含的TritonX-100等細(xì)胞裂解劑成分，能夠起到裂解細(xì)胞釋放DNA 的作用[5-7]；②反應(yīng)緩沖液中加入了Betaine、Tween20等PCR增強(qiáng)劑，可以抵抗血色素等的抑制作用[6-7]；③特效的HS-Taq聚合酶對(duì)血紅素、腐殖酸等抑制物的耐受性更強(qiáng)。

采用直接擴(kuò)增方法，取樣直徑和PCR循環(huán)次數(shù)等主觀因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。本文結(jié)果顯示，在成功STR分型的前提下，應(yīng)盡量減少取樣量和循環(huán)次數(shù)，以減少體系中PCR抑制物的含量和降低高濃度產(chǎn)物所產(chǎn)生的滲透峰對(duì)判型的影響。對(duì)于FTA卡等紙質(zhì)較厚的采血卡，選擇0.5 mm和27/28次循環(huán)；對(duì)于較薄的采血卡，則選擇1.0 mm和27/28 次循環(huán)為宜；如果樣本質(zhì)量較差或保存時(shí)間較長(zhǎng)，可適當(dāng)增加取樣量和循環(huán)次數(shù)(29/30次)。為了達(dá)到快速檢驗(yàn)，本文通過(guò)優(yōu)化程序使PCR反應(yīng)時(shí)間為70 min(兩步法)和90 min(三步法)，在同等取樣直徑和PCR循環(huán)次數(shù)的情況下，兩步法和三步法的檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)差別，批量檢驗(yàn)92份樣本(1個(gè)96孔板) 的時(shí)間在5 h內(nèi)(取樣30 min、PCR擴(kuò)增70～90 min、電泳160 min、其他20 min)，滿足DNA數(shù)據(jù)庫(kù)大規(guī)模樣本快速檢測(cè)的要求。

STRtyper-21G Plus與PowerPlex?21試劑盒包含的21個(gè)基因座一樣，但PowerPlex?21試劑盒的allelic ladder優(yōu)于STRtyper-21G Plus。而Bin是通過(guò)分析同一個(gè)基因座在人群中所有等位基因的片段大小，輸入標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)并由軟件生成類似于allelic ladder的虛擬分型標(biāo)準(zhǔn)物，因此bin在沒(méi)有allelic ladder時(shí)可作為分型的標(biāo)準(zhǔn)。更多的allelic ladder及bin可以為基因分型分析提供更全面的參照。如圖6所示，當(dāng)基因座D21S11分型存在微變異時(shí)，由于PowerPlex?21存在30.3的虛擬bin，軟件分析后自動(dòng)標(biāo)注為30.3，而STRtyper-21G Plus只能標(biāo)注為off-ladder，需要后期人工識(shí)別。因此，在國(guó)產(chǎn)化的試劑盒中，STR基因座要設(shè)計(jì)符合中國(guó)人群的allelic ladder和bin，如Penta E基因座在歐洲人群檢測(cè)的等位基因數(shù)量明顯少于亞洲人群[8]，所以STRtyper-21G Plus與PowerPlex?21試劑盒的allelic ladder均為5～24，但STRtyper-21G Plus試劑盒的bin為4～28，而PowerPlex?21試劑盒為4～25。為提高allelic ladder分型的正確率，不要將其采用同一個(gè)毛細(xì)管電泳(即放在1個(gè)96孔板的不同位置，如6H和12F)；同時(shí)為了防止引物設(shè)計(jì)不同而使分析軟件錯(cuò)誤分型[9-10]，一般先用一種軟件(如GeneMarker?HID或IDproof)分析，再用另外一種軟件(如GeneMapperID-X)復(fù)核分析，無(wú)誤后再輸入DNA數(shù)據(jù)庫(kù)?？傊褂脟?guó)產(chǎn)STR試劑盒進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，一定要確定off-ladder的位置(ladder之內(nèi)、ladder之外size之內(nèi)或是size之外)，切不可盲目標(biāo)記。

綜上，STRtyper-21G Plus試劑盒分型結(jié)果準(zhǔn)確，提高了系統(tǒng)檢測(cè)效能，采用本文優(yōu)化方法用于紙質(zhì)血樣的批量檢驗(yàn)，不僅減少了操作流程和污染機(jī)會(huì)，而且具有較高的成功率和較好的穩(wěn)定性、均一性，適合于DNA數(shù)據(jù)庫(kù)紙質(zhì)血樣的快速批量檢驗(yàn)。

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2015-01-23

1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南許昌 461000 2.襄城縣公安局刑偵大隊(duì)，河南襄城 461700 3.寧波海爾施基因科技有限公司，浙江寧波315000

劉亞舉(1978-)，男，河南襄城人，副主任法醫(yī)師，從事DNA檢驗(yàn)及法醫(yī)遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)工作。

DF795.2

B

1672-688X(2015)02-0142-04