泰山磐石散加味對(duì)大鼠流產(chǎn)模型母胎界面Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的調(diào)控*

申 劍，浦佳希，孫 亮，張小花，武權(quán)生，王虎平

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)婦科教研室， 甘肅 蘭州 730000； 2.定西市婦幼保健院，甘肅 定西 743000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

泰山磐石散加味對(duì)大鼠流產(chǎn)模型母胎界面Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的調(diào)控*

申 劍1，浦佳希1，孫 亮2，張小花1，武權(quán)生1，王虎平1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)婦科教研室， 甘肅 蘭州 730000； 2.定西市婦幼保健院，甘肅 定西 743000)

目的：通過(guò)觀察泰山磐石散加味對(duì)大鼠流產(chǎn)模型白細(xì)胞介素4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)的影響來(lái)了解其對(duì)母胎界面Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的調(diào)控，探究其作用機(jī)制。方法：將56只已孕Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為空白對(duì)照組、流產(chǎn)模型對(duì)照組、環(huán)境模型對(duì)照組、泰山低劑量組、泰山中劑量組、環(huán)境泰山低劑量組、環(huán)境泰山中劑量組7組。以米非司酮建立流產(chǎn)模型，涉及環(huán)境的組別在其基礎(chǔ)上再置于輻射和煙霧的環(huán)境造模。在妊娠第1天至第15天予以灌胃，分別給予低劑量 (7.26 g/kg)、中劑量 (14.52 g/kg)的泰山磐石散，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組每日以4 mL蒸餾水灌胃1次。于大鼠妊娠第16天股動(dòng)脈采血，ELISA法檢測(cè)IL-4、IFN-γ。結(jié)果：與流產(chǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，泰山低、中劑量組IL-4升高、IFN-γ降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，環(huán)境泰山低、中劑量組IL-4升高、IFN-γ降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。環(huán)境泰山低劑量組與泰山低劑量組、環(huán)境泰山中劑量組與泰山中劑量組之間二指標(biāo)對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：泰山磐石散加味對(duì)流產(chǎn)模型、環(huán)境流產(chǎn)模型能有效上調(diào)Th2細(xì)胞因子并抑制Thl細(xì)胞因子，Th1/Th2傾斜使母體排異反應(yīng)降低，對(duì)環(huán)境模型Th1/Th2傾斜調(diào)節(jié)效果更明顯。

泰山磐石散/藥效學(xué);流產(chǎn);IL-4;IFN-γ;環(huán)境

泰山磐石散出自《古今醫(yī)統(tǒng)大全·胎產(chǎn)須知/治懷胎慣墮之病》，“泰山磐石散：治婦人氣血兩虛，身體素弱，或肥而不實(shí)，或瘦而血熱，或脾胃少食，四肢倦息，素有墜胎之患……戒欲惱，遠(yuǎn)酒酸辛熱之味，永保無(wú)墮”。[1]臨床常用其治療先兆流產(chǎn)、習(xí)慣性或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察泰山磐石散加味對(duì)大鼠流產(chǎn)模型白細(xì)胞介素4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)的影響來(lái)了解其對(duì)母胎界面Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡的調(diào)控，探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

選取10～12周齡、體質(zhì)量180～220 g的SPF級(jí)Wistar大鼠84只，其中雌性未孕大鼠56只，雄性大鼠28只。所有大鼠均由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

泰山磐石散加味的藥物組成：黨參15 g，黃芪35 g，白術(shù)20 g，山藥15 g，白芍15 g，熟地黃12 g，川續(xù)斷15 g，桑寄生12 g，杜仲12 g，砂仁6 g，炙甘草6 g。根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物劑量體質(zhì)量折算系數(shù)[2]計(jì)算，煎煮2次后，藥液混合，濃縮到630 mL, 由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供；米非司酮片，25 mg/片，北京紫竹藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)43121703，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院西藥房提供。IL-4、IFN-γ ELISA分析藥盒，購(gòu)自北京市福瑞生物工程公司，批號(hào)分別為20130711A、20130601A。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與模型的建立

將SPF級(jí)wistar大鼠按雌雄2∶1比例合籠，自由進(jìn)食飲水，每日清晨觀察雌鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓計(jì)為妊娠第1天。將56只已孕Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、流產(chǎn)模型對(duì)照組、環(huán)境模型對(duì)照組、泰山低劑量組、泰山中劑量組、環(huán)境泰山低劑量組、環(huán)境泰山中劑量組7組。各藥物組在妊娠第1天至第15天予以相應(yīng)藥物灌胃，根據(jù)文獻(xiàn)[2]給予低劑量 (7.26 g/kg)、中劑量 (14.52 g/kg)的泰山磐石散；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組每日以4 mL蒸餾水灌胃1次。

先兆流產(chǎn)模型的建立：參照馮曉玲等[2]的造模方法及預(yù)實(shí)驗(yàn)情況。除空白對(duì)照組外，在妊娠第10天給其余6組大鼠灌服米非司酮3.75 μg/g建立模型，觀察大鼠陰道出血及胚胎排出情況。

環(huán)境污染模型的建立：在米非司酮流產(chǎn)模型基礎(chǔ)上，建立輻射和煙霧的環(huán)境流產(chǎn)模型。在妊娠后將環(huán)境泰山低劑量組、環(huán)境泰山中劑量組、環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組放置于電話(huà)輻射、煙霧環(huán)境。參考陳鎮(zhèn)燕等[3]及張瑞等[4]被動(dòng)吸煙造模，吸煙用玻璃箱容積 0. 25 m3(100 cm× 50 cm× 50 cm)。所有大鼠妊娠后開(kāi)始吸煙,每日2次,每次1 h, 1 h內(nèi)迅速燃完4支香煙。煙選甘肅煙草公司的蘭州煙，焦油含量7 mg，煙氣煙堿量0.6 mg,煙氣一氧化碳量8 mg。同時(shí)，參考李樂(lè)等[5]手機(jī)輻射造模：電話(huà)為常用三星手機(jī)s7562，孕鼠每次通話(huà)時(shí)間分別為30 min，每日于早、中、晚固定時(shí)間輻射，直至孕鼠處死。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

各組大鼠于妊娠第16天股動(dòng)脈采血后處死。將所采血液靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取血清。采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-4、IFN-γ水平，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況對(duì)比

大鼠在造模前后進(jìn)食量、飲水量均未發(fā)生明顯變化。除空白對(duì)照組外，其余各組孕鼠均出現(xiàn)不同程度的易激惹、陰道流血癥狀，但無(wú)妊娠物排出。

2.2 各組血清IL-4、IFN-γ水平對(duì)比

與空白對(duì)照組對(duì)比，流產(chǎn)模型對(duì)照組、環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組IL-4降低、IFN-γ升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功。與流產(chǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，泰山低、中劑量組IL-4升高、IFN-γ降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，環(huán)境泰山低、中劑量組IL-4升高、IFN-γ降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；環(huán)境泰山低劑量組與泰山低劑量組、環(huán)境泰山中劑量組與泰山中劑量組之間對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清IL-4、IFN-γ水平對(duì)比

組 別動(dòng)物數(shù)IL-4IFN-γ空白對(duì)照組81.245±0.05 0.45±0.05 流產(chǎn)模型對(duì)照組80.819±0.06**0.81±0.01**環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組80.728±0.14**0.86±0.03**泰山低劑量組81.059±0.131##0.59±0.10##泰山中劑量組81.53±0.09## 0.43±0.05## 環(huán)境泰山低劑量組81.262±0.01△△**0.459±0.05△△**環(huán)境泰山中劑量組81.690±0.02△△▲▲0.361±0.05△△▲

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與流產(chǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.01；與環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組對(duì)比，△△P<0.01；與泰山低劑量組對(duì)比，＊＊P<0.01；與泰山中劑量組對(duì)比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 討 論

導(dǎo)致流產(chǎn)的原因很多，免疫因素是其中之一。妊娠表達(dá)父母雙親的基因，因此母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞同時(shí)表達(dá)父系和母系雙方的同種異型抗原，可誘發(fā)同種異體的免疫識(shí)別或排斥反應(yīng)。神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫組成了母胎界面的完整的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[6]。母胎界面的免疫調(diào)節(jié)對(duì)妊娠成敗非常重要。

細(xì)胞因子分為T(mén)hl與Th2型細(xì)胞因子兩類(lèi)。Thl型細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素2(IL-2)、γ干擾素(IFN-γ)、α腫瘤壞死因子(TNF-α)等，參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過(guò)程。Th2型細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素4(IL-4)、IL-6、IL-10等，主要為IL-4驅(qū)動(dòng)誘發(fā)，輔佐B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，促進(jìn)抗體介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)過(guò)程。Th2細(xì)胞因子作用增強(qiáng)而Thl細(xì)胞因子作用減弱在母胎界面中表現(xiàn)為正常妊娠。多量的Thl炎性細(xì)胞因子，具有流產(chǎn)傾向，不利于妊娠；但少量的炎性細(xì)胞因子不僅不會(huì)危害妊娠，而且還有助于蛻膜免疫微環(huán)境的保持，在一定程度上能夠清除異常的胎兒及入侵的微生物，對(duì)妊娠起到免疫防御作用[6]。免疫細(xì)胞因子在母胎界面的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用。

泰山磐石散加味對(duì)流產(chǎn)大鼠干預(yù)結(jié)果表明：可使IL-4值升高，Th2表達(dá)上調(diào)，IFN-γ值降低，Th1表達(dá)下調(diào)，Th1/Th2傾斜使母體排異反應(yīng)降低，泰山磐石散加味可通過(guò)對(duì)母胎界面調(diào)節(jié)達(dá)到維持妊娠，可防治流產(chǎn)目的，所有治療中劑量更有效。

環(huán)境因素是生活中難以避免的因素，張瑞等[4]、李樂(lè)等[5]都報(bào)道了環(huán)境對(duì)妊娠的影響。本實(shí)驗(yàn)中流產(chǎn)模型對(duì)照組與環(huán)境流產(chǎn)模型對(duì)照組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)輻射、煙霧因素累加后對(duì)孕鼠的影響與單獨(dú)米非司酮造成的影響沒(méi)有大的差別。環(huán)境泰山低劑量組與泰山低劑量組、環(huán)境泰山中劑量組與泰山中劑量組之間IL-4、IFN-γ值對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明泰山磐石散在有環(huán)境因素影響模型中上調(diào)Th2細(xì)胞因子并抑制Thl細(xì)胞因子的效果更明顯，提示其對(duì)有環(huán)境因素影響者更為有效。

方中人參(黨參代)、黃芪、白術(shù)、山藥、甘草補(bǔ)中益氣以載胎；川續(xù)斷、桑寄生養(yǎng)肝益腎以固胎，白芍、熟地黃補(bǔ)血滋陰以養(yǎng)胎；砂仁健脾理氣，防補(bǔ)藥之膩。原方當(dāng)歸、川芎有活血功能，因此剔除不用。全方益氣健脾，開(kāi)后天之源；養(yǎng)血固腎，攝先天之本?，F(xiàn)代藥理研究表明：白術(shù)具有抗菌、抗凝、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制子宮收縮的作用[8]。黃芪可影響多種免疫細(xì)胞活性、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌、抗體生成等[9]。黨參多糖能明顯增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞免疫。杜仲化學(xué)活性成分包含黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、苯丙素類(lèi)，有提高機(jī)體免疫作用的重要作用[10]。杜仲、川續(xù)斷等補(bǔ)陽(yáng)藥可促進(jìn)垂體對(duì)促性腺激素釋放激素的反應(yīng)性，促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善母胎界面Th1 / Th2型細(xì)胞的比值，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與凋亡作用，對(duì)子宮平滑肌有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用[11]。桑寄生能使卵巢hCG/LH受體結(jié)合力及受體數(shù)目增加，對(duì)下丘腦—垂體—性腺軸有調(diào)整作用[12]。

泰山磐石散加味臨床使用，對(duì)有流產(chǎn)史者，可預(yù)培其損；對(duì)檢查無(wú)異常但欲孕而未得者，可夯基址安心志；對(duì)因虛而經(jīng)亂者，可補(bǔ)氣血調(diào)經(jīng)水；對(duì)先兆流產(chǎn)、胎萎不長(zhǎng)等，可補(bǔ)氣以托載固攝，養(yǎng)血以滋養(yǎng)濡潤(rùn)；對(duì)不孕、胚胎停育、自然流產(chǎn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)等免疫因素導(dǎo)致者，療效顯著。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)05-0071-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.05.33

張小花，講師，碩士，283005688@qq.com

甘肅中醫(yī)學(xué)院中青基金項(xiàng)目(ZQ2011-19)

2014-12-08；

2015-03-20