HPLC同時(shí)測(cè)定甘肅不同產(chǎn)地黃芩及不同炮制品中黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的含量*

楊志軍,楊秀娟,耿廣琴,李 晶,鄧 毅

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

·藥學(xué)研究·

HPLC同時(shí)測(cè)定甘肅不同產(chǎn)地黃芩及不同炮制品中黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的含量*

楊志軍,楊秀娟,耿廣琴,李 晶,鄧 毅

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

目的:建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定甘肅不同產(chǎn)地黃芩及不同炮制品中黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的含量。方法：采用Phecda C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-2 g/L冰醋酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃。結(jié)果：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的線(xiàn)性范圍分別為0.06～9.00 μg(r=0.999 9)，0.001 0～0.300 0 μg(r=0.999 9)，0.001 05～0.315 0 μg(r=0.999 96)，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均回收率分別為102.77% (RSD=3.64%)，98.75% (RSD=1.31%)，96.90%(RSD=1.84%)。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、可用于黃芩的質(zhì)量控制。

黃芩；高效液相色譜法；黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素;含量測(cè)定；炮制；甘肅

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效[1]。現(xiàn)代研究顯示其具有抗心律失常、抑菌、抗癌等作用[2-3]。黃芩的主要活性成分有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等，不同炮制方法對(duì)其含量亦有影響[4-5]。黃芩雖非甘肅道地藥材，但由于近年來(lái)栽培面積大、產(chǎn)量高，臨床療效好，已被確定為甘肅“十大隴藥”之一。本研究擬采用高效液相色譜法建立同時(shí)測(cè)定甘肅隴西、岷縣、漳縣及渭源4個(gè)代表產(chǎn)區(qū)黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素3種主要成分的方法，并分別測(cè)定4個(gè)產(chǎn)地的生黃芩、酒黃芩和黃芩炭中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，以探討并比較甘肅不同產(chǎn)區(qū)黃芩及其不同炮制品的質(zhì)量差異，并為下一步進(jìn)行甘肅不同產(chǎn)區(qū)黃芩的藥效研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為更好地開(kāi)發(fā)、利用甘肅資源打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品、試劑與儀器

黃芩于2014年11月初采自甘肅省隴西縣文峰鎮(zhèn)(1100)、隴西縣首陽(yáng)鎮(zhèn)(1101)、岷縣(1102)、渭源縣(1103)、漳縣(1104)，均為兩年生植物，按采集次序依次編號(hào)為1100-1104，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杜弢教授鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。甲醇為色譜純，磷酸等其他試劑均為分析純，購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)10715-201117)、黃芩素對(duì)照品(批號(hào)111595-201306)、漢黃芩素對(duì)照品(批號(hào)111514-200403)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。Agilent 1260高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，四元泵)，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Phecda C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Hanbon Sci. & Tech.公司產(chǎn)品；AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；HH-S恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；KQ-250超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SFG-02B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.2 炮制品制備

生品黃芩的制備：取黃芩，除去雜質(zhì)，置沸水中煮10 min，取出，燜透，切薄片，干燥。 酒制黃芩的制備：將黃芩以溫水泡1 h，加酒拌勻，蒸至上氣時(shí)取出，切片，干燥(每100 kg黃芩，用酒12.5 kg)。炒炭黃芩的制備：取黃芩片，置鍋內(nèi)用武火加熱，炒至黑褐色時(shí)，噴淋清水少許，滅盡火星，取出，晾透。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Phecda C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為20 mL/L冰醋酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0-25 min，50%～25%A；25-30 min，25%～50%A)，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)277 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取黃芩苷6.00 mg、黃芩素 5.00 mg、漢黃芩素對(duì)照品 5.25 mg，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 600,500，525 mg/L的黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素對(duì)照品貯備液。精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 mg/L的黃芩苷對(duì)照品稀釋液；再精密吸取黃芩素及漢黃芩素對(duì)照品溶液各1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20， 21 mg/L 的黃芩素和漢黃芩素混合對(duì)照品溶液A；再精密吸取黃芩素及漢黃芩素混合對(duì)照品溶液各0.5 mL，置10 mL量瓶中，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00，1.05 mg/L的黃芩素和漢黃芩素混合對(duì)照品溶液B。精密量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為600 mg/L的黃芩苷貯備液及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20,21 mg/L的黃芩素和漢黃芩素對(duì)照品混合溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量分別為60，2.0，2.1 mg/L的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取黃芩藥材粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.3 g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，加入700 mL/L乙醇40 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過(guò)；濾液置100 mL量瓶中，加700 mL/L乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加700 mL/L乙醇至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀。

2.4 線(xiàn)性考察

分別精密吸取2.2項(xiàng)下質(zhì)量分?jǐn)?shù)為600 mg/L的黃芩苷對(duì)照品貯備液①2.5，5，10，15 μL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 mg/L的黃芩苷對(duì)照品稀釋液②1，2.5，5，10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積，再分別精密吸取2.2項(xiàng)下的黃芩素和漢黃芩素混合對(duì)照品溶液A 1，2.5，5，10，15 μL和混合對(duì)照品溶液B 1，2.5，5，10 μL，分別以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果表明：黃芩苷在0.06～9.00 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3 512.4X-115.4(r=0.999 9)；黃芩素在0.001 0～0.300 0 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為Y=5 406.6X+0.062 2(r=0.999 9)；漢黃芩素在0.001 05～0.315 0 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為Y=6 047.6X+2.021 1(r=0.999 96)。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積RSD值分別為0.48%、0.40%和0.52%。結(jié)果表明：儀器具有良好的精密度。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取同一批藥材，按2.3 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果:黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均含量分別為153.44,4.54,1.49 mg/g，RSD分別為2.60%、3.18%、3.08%(n=6)。結(jié)果表明：重復(fù)性較好。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.黃芩苷; 2.黃芩素;3.漢黃芩素;A.對(duì)照品;B.黃芩樣品圖1 黃芩含量測(cè)定HPLC色譜圖

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，并分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果：3種待測(cè)黃酮峰面積的RSD分別為黃芩苷0.29%，黃芩素0.78%，漢黃芩素1.54%。結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量分別為153.44，4.54，1.49 mg/g的黃芩藥材6份，每份約0.15 g，加入黃芩苷對(duì)照品約22 mg，精密稱(chēng)定，精密加入黃芩素對(duì)照品溶液(500 mg/L) 1.4 mL、漢黃芩素對(duì)照品溶液(525 mg/L)0.45 mL，以下按2.3方法制備加樣回收供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 含量測(cè)定

鑒于岷縣酒制品、渭源酒制品中漢黃芩素的含量及岷縣炒炭品中黃芩苷的含量過(guò)低，故在2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法基礎(chǔ)上，將最后一步改為精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。其余樣品按2.3項(xiàng)下方法制備。按選定的色譜條件對(duì)甘肅不同產(chǎn)地及不同炮制品的黃芩中黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素進(jìn)行測(cè)定，每批平行3次，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 n=6

表2 甘肅不同產(chǎn)地及不同炮制品黃芩中黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素含量測(cè)定 n=3

3 討 論

目前2010版《中國(guó)藥典》一部黃芩項(xiàng)下僅以黃芩苷的含量測(cè)定方法為標(biāo)準(zhǔn)，而黃芩苷在內(nèi)源酶催化水解作用下會(huì)產(chǎn)生大量黃芩素[7]；因此僅以黃芩苷作為指標(biāo)不能全面評(píng)價(jià)黃芩藥材的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立同時(shí)測(cè)定甘肅黃芩中黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素含量的測(cè)定方法，為全面衡量及綜合評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量提供了參考。

在色譜條件的考察過(guò)程中，我們對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相組成、樣品提取方式、提取溶劑及提取時(shí)間做了考察，經(jīng)HPLC-DAD檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素在波長(zhǎng)277 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]基本一致。通過(guò)考察甲醇及700 mL/L乙醇兩種溶媒及提取時(shí)間30 min、45 min、1 h、3 h，優(yōu)化出最佳提取條件為黃芩用700 mL/L乙醇超聲處理30 min。本實(shí)驗(yàn)以甘肅省黃芩產(chǎn)量較大的隴西、漳縣、渭源及岷縣4個(gè)產(chǎn)區(qū)的黃芩為研究對(duì)象進(jìn)行黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素3種成分的含量比較，結(jié)果：4個(gè)產(chǎn)地生品黃芩中黃芩苷含量均符合2010版《中國(guó)藥典》一部飲片標(biāo)準(zhǔn)，不同產(chǎn)地黃芩生品中黃芩苷含量由高到低依次為漳縣>渭源>隴西>岷縣，黃芩素含量由高到低依次為隴西>漳縣>渭源>岷縣，漢黃芩素含量由高到低依次為漳縣>渭源>岷縣>隴西。結(jié)果顯示：不同產(chǎn)地的黃芩中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量存在一定差異。黃芩的炮制方法很多，現(xiàn)代炮制中最常用的方法為蒸法、酒法及炒炭。本研究用以上3種炮制方法對(duì)4個(gè)產(chǎn)區(qū)的黃芩進(jìn)行炮制，以不同產(chǎn)區(qū)中3種成分含量最高隴西進(jìn)行比較，結(jié)果：黃芩苷的含量由高到低依次為生品黃芩>酒制黃芩>炒炭黃芩，黃芩素和漢黃芩素的含量由高到低依次為炒炭黃芩>生品黃芩、酒制黃芩。此與黃芩炒炭后黃芩苷的含量下降、黃芩素與漢黃芩素的含量顯著升高的文獻(xiàn)報(bào)道[11]一致，提示炒炭后黃芩由于受到局部高熱會(huì)導(dǎo)致黃芩苷等黃酮苷分解破壞，可轉(zhuǎn)化成苷元。

本研究采用HPLC測(cè)定黃芩的3種主要成分，確定甘肅最佳的黃芩產(chǎn)區(qū)及最佳的炮制方法，為下一步進(jìn)行甘肅產(chǎn)黃芩的藥效研究及有效成分的提取打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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(編輯 陶 珠)

《中醫(yī)研究》雜志投稿信箱：zgzyyj@126.com

1001-6910(2015)09-0072-04

R284.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.09.35

楊志軍(1971-)，女(漢族)，甘肅天水人，副教授，在讀博士研究生，主要從事中藥及復(fù)方化學(xué)成分與藥效研究。

鄧毅，教授，博士生導(dǎo)師， dengyi@gszy.edu.cn

甘肅省高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(BH2012-020);甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年基金項(xiàng)目(2305016601)

2015-03-31；

2015-07-06