梔子中有效成分對(duì)A549細(xì)胞XOD活性及其mRNA表達(dá)的影響研究※

● 朱繼孝 李雪溦 曾金祥 羅光明 朱玉野 王曉云

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梔子中有效成分對(duì)A549細(xì)胞XOD活性及其mRNA表達(dá)的影響研究※

● 朱繼孝*李雪溦 曾金祥 羅光明 朱玉野 王曉云

目的：研究梔子中有效成分對(duì)A549細(xì)胞黃嘌呤氧化酶(XOD)活性及其mRNA表達(dá)的影響。方法：選擇梔子中5個(gè)化合物(梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯)，研究其對(duì)A549細(xì)胞體內(nèi)XOD活性的抑制作用，并采用RT-PCR檢測(cè)別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I對(duì)XOD mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：梔子苷、西紅花苷-I和山梔苷甲酯50、100μmol·L-1處理組細(xì)胞XOD活性與空白對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)，其中梔子苷和西紅花苷-I對(duì)XOD抑制作用較強(qiáng)，西紅花苷-II和去乙酰車前草酸甲酯 對(duì)A549細(xì)胞XOD活性的抑制較弱，與空白對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I各劑量處理組的XOD mRNA水平與空白對(duì)照組相比均沒有顯著差異(P>0.05)。結(jié)論：梔子苷和西紅花苷-I對(duì)XOD活性抑制作用可能是梔子降尿酸作用機(jī)制之一。

梔子 痛風(fēng) 黃嘌呤氧化酶

痛風(fēng)是一種嘌呤代射紊亂所致的疾病，其臨床表現(xiàn)主要是反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病、痛風(fēng)凝結(jié)物沉積、尿酸性泌尿系統(tǒng)凝結(jié)物生成，關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛反復(fù)發(fā)作，尤以第一跖趾關(guān)節(jié)最為常見，關(guān)節(jié)周圍有痛風(fēng)石單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)沉積[1]。血尿酸升高是痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)[2]。近年來，痛風(fēng)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制及藥物治療和新藥研發(fā)已越來越引起人們的重視。XOD是體內(nèi)催化黃嘌呤、次黃嘌呤氧化生成尿酸的酶。本課題組前期研究表明梔子提取物及不同部位能顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，抑制XOD活性是其降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的機(jī)制之一[3-4]。本研究選擇梔子中的5個(gè)化合物，研究其對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 XOD活性的影響，進(jìn)一步研究梔子降尿酸可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 UV2100紫外可見分光光度儀(北京瑞利分析儀器公司)；電熱恒溫水溫箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Beckman-Coulter公司)；YXQ-LS-50A全自動(dòng)高壓滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientfic公司)；MJ-PTC200 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；DYY-III-5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 試劑 梔子苷(批號(hào)：110749-201214)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；西紅花苷-I(批號(hào)：1275-120709)、西紅花苷-ΙΙ(批號(hào)：1276-120709)、山梔苷甲酯(批號(hào)：1335-130411)、去乙酰車前草酸甲酯(批號(hào)：1338-130411)均購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；新生牛血清(杭州四季青公司)；DMEM干粉、Penicilin-Streptomycin、胰酶(Gibco公司)；Trizol Reagent (美國(guó)Invitrogen公司)；M-mLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。人肺癌細(xì)胞A549由江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。XOD引物：上游： 5’-TCGTCCAGGGTCTTGGTCTC-3’，下游：5’- GGCGTTACTGTCTCCGTGCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為275bp；GAPDH內(nèi)參引物：上游：5’-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGT-3’，下游：5’-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為299 bp；均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液含100IU·mL-1的青霉素和卡那霉素，于37℃下5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天稀釋傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，加入1mL DMEM培養(yǎng)液。

2.2 梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯對(duì)A549細(xì)胞體內(nèi)XOD活性的影響

2.2.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為14組，每組6孔，包括對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組，空白對(duì)照組單純用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，DMSO對(duì)照組加入終濃度為1%的DMSO，實(shí)驗(yàn)組別嘌呤醇、梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯、去乙酰車前草酸甲酯用DMSO溶解，處理終濃度分別為50μmol·L-1和100μmol·L-1。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)XOD的提取 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，再置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3h，取出，傾去培養(yǎng)液，用pbs緩沖液(pH7.5，200mM)洗滌1次，加入少量胰酶消化2～3min，加入1mL培養(yǎng)液終止消化，吸出細(xì)胞懸液置于離心管中，1000rpm·min-1離心5min(4℃)，棄去上清液，沉淀加入0.5mL pbs緩沖液(pH7.5，200mM)，超聲15min破碎細(xì)胞，12000rpm·min-1離心10min(4℃)，取上清液，用于XOD活性測(cè)定。

2.2.3 XOD活性的測(cè)定 取細(xì)胞離心上清液0.35mL，加到pH8.0磷酸鉀鹽緩沖液200mM(含有1mM的EDTA-Na)中，置于37℃水浴中，再加入底物黃嘌呤溶液(終濃度為100μM)開始反應(yīng)，反應(yīng)30min后加入0.25mL HCl(0.58M)終止反應(yīng)?？瞻讓?duì)照液中不加入細(xì)胞離心上清液，預(yù)先加入0.25mL HCl(0.58M)終止反應(yīng)。在290nm處測(cè)定吸收度。細(xì)胞離心上清液總蛋白質(zhì)的測(cè)定用Lowry法測(cè)定，以小牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2.3 RT-PCR檢測(cè)別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I對(duì)XOD 基因表達(dá)的影響

2.3.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為24組，每組4孔，包括對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。其中8組經(jīng)藥物處理12h后檢測(cè)XOD mRNA含量，對(duì)照組為空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組別嘌呤醇、梔子苷、西紅花苷-I根據(jù)抑制曲線分別選擇對(duì)XOD活性抑制50%和70%的處理終濃度，其中別嘌呤醇處理終濃度分別為11μmol·L-1和26μmol·L-1，梔子苷處理終濃度分別為45μmol·L-1和200μmol·L-1，西紅花苷-I處理終濃度分別為41μmol·L-1和200μmol·L-1；另外8組經(jīng)藥物處理24h后檢測(cè)XOD mRNA含量，實(shí)驗(yàn)分組同12h處理；最后8組經(jīng)藥物處理48h后檢測(cè)XOD mRNA含量，實(shí)驗(yàn)分組同12h給藥處理。

3 結(jié)果

3.1 梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯對(duì)A549細(xì)胞體內(nèi)XOD活性的影響 藥物處理3h，DMSO對(duì)照組與空白對(duì)照組無顯著差異，別嘌呤醇50、100μmol·L-1處理組A549細(xì)胞XOD活性與空白對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)，對(duì)A549細(xì)胞XOD活性的抑制率分別為72.25%和74.34%，梔子苷、西紅花苷-I和山梔苷甲酯50、100μmol·L-1處理組細(xì)胞XOD活性與空白對(duì)照組也有極顯著差異(P<0.01)，其中梔子苷和西紅花苷-I對(duì)XOD抑制作用較強(qiáng)，西紅花苷-II和去乙酰車前草酸甲酯對(duì)A549細(xì)胞XOD活性的抑制較弱，僅有西紅花苷-II 100μmol·L-1處理組的細(xì)胞XOD活性與空白對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。除去乙酰車前草酸甲酯組，各化合物高劑量組對(duì)細(xì)胞XOD活性的抑制率均大于該化合物低劑量組(P<0.05)。梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯、去乙酰車前草酸甲酯對(duì)細(xì)胞XOD活性的抑制均弱于相同劑量的別嘌呤醇。見表1。

表1 梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯、去乙酰車前草酸甲酯和別嘌呤醇處理

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.2 RT-PCR檢測(cè)別嘌呤醇、桅子苷和西紅花苷-1對(duì)XOD基因表達(dá)的影響 藥物處理12h、24h、48h，瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴(kuò)增條帶清晰，DMSO對(duì)照組與空白對(duì)照組XOD mRNA水平接近，別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I各劑量處理組的XOD表達(dá)與空白對(duì)照組相比均沒有顯著差異。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞中XOD基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)果

4 討論

隨著人們生活水平的不斷提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)患病率逐年升高，人們對(duì)痛風(fēng)的發(fā)病和治療也越來越重視。西藥治療痛風(fēng)起效快，療效好，藥物作用的機(jī)理研究較為深入，對(duì)于痛風(fēng)的急性治療和慢性治療均有相應(yīng)的有效藥物，但西藥治療痛風(fēng)不良反應(yīng)較大，秋水仙堿有效劑量和中毒劑量相近，具有腎毒性[5]，非甾體類抗炎藥具有胃腸道毒性[6]，腎上腺皮質(zhì)激素與促腎上腺皮質(zhì)激素停藥后往往出現(xiàn)“反跳”現(xiàn)象[7]，促尿酸排泄藥會(huì)引起尿酸鹽晶體在尿路的沉積，引發(fā)腎絞痛和腎功能損害[8]，而目前臨床應(yīng)用廣泛的抑制尿酸生成藥別嘌呤醇雖然價(jià)格便宜，抑制XOD效果好，但副作用也多，包括過敏性皮疹、史蒂文斯-約翰遜綜合癥、腎毒性[9-10]等。西藥的不良反應(yīng)限制了其在痛風(fēng)治療過程中的使用。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)毒性小，許多學(xué)者作了臨床研究，取得了一定的治療效果。中草藥來源的XOD抑制劑，毒性低且來源廣泛，在有效阻止和延緩?fù)达L(fēng)、高尿酸血癥等疾病方面顯示了良好的應(yīng)用前景。

從多種細(xì)胞株中可以富集得到XOD，如人肺癌細(xì)胞A549[11]、人慢性髓性白血病細(xì)胞系K562[12]等，有報(bào)道測(cè)定了人肺癌細(xì)胞A549中的嘌呤代謝過程多個(gè)酶的活性，包括黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)、鳥嘌呤酶(Guanase)，XOD抑制劑只抑制A549細(xì)胞中的XOD活性，而對(duì)其它酶沒有抑制作用[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇人肺癌細(xì)胞A549，開展梔子有效成分的體外實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)A549細(xì)胞XOD活性及其mRNA表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇梔子中所含有的5個(gè)化合物，研究其對(duì)人肺癌細(xì)胞A549 XOD活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)梔子苷和西紅花苷-I對(duì)于細(xì)胞XOD活性的抑制效果強(qiáng)于山梔苷甲酯、西紅花苷-II、去乙酰車前草酸甲酯。梔子苷和西紅花苷-I呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本相符，進(jìn)一步佐證梔子苷和西紅花苷-I對(duì)XOD活性抑制作用可能是其降尿酸作用機(jī)制之一。細(xì)胞經(jīng)梔子苷和西紅花苷-I處理后，RT-PCR結(jié)果顯示XOD mRNA表達(dá)沒有顯著變化，表明梔子苷和西紅花苷-I抑制XOD活性與XOD mRNA表達(dá)可能沒有直接關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

[1]Okamoto K. Inhibitors of xanthine oxidoreductase[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine，2008，66(4)：748-753.

[2]徐 嬌，易立濤，翁連進(jìn)，等. 月腺大戟乙醇提取物的抗痛風(fēng)活性研究[J]. 中藥材，2014，37(2)：320-323.

[3]朱繼孝，朱玉野，羅光明，等. 梔子提取物降低小鼠急性高尿酸血癥血尿酸水平及機(jī)理研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(36)：22317-22318.

[4]朱繼孝，曾金祥，羅光明，等. 梔子降尿酸有效部位研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(14)：140-143.

[5]陳雪梅，柳 軍，宋金萍，等. 秋水仙堿對(duì)大鼠腎細(xì)胞NRK體外毒性機(jī)制初步探討[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16(5)：496-500.

[6]Hochberg，MC. COX-2 selective inhibitors in the treatment of arthritis：a rheumatologist perspective[J]. Curr Top Med Chem，2005，5(5)：443-448.

[7]常 明，楚文南，謝惠民. 腎上腺皮質(zhì)激素的合理應(yīng)用[J]. 中國(guó)醫(yī)刊，2008，43(7)：7-12.

[8]劉二剛. 抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中藥的研究[D]. 浙江大學(xué)，2012.

[9]楊 媛，李 靜，甄健存，等. 抗痛風(fēng)藥別嘌呤醇、苯溴馬隆及秋水仙堿不良反應(yīng)報(bào)告分析[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(15)：1297-1298.

[10]Okamoto K.Inhibitors of xanthine oxidoreductase[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine. 2008，66(4)：748-753.

[11]Papi A1，Contoli M，Gasparini P. Role of xanthine oxidase activation and reduced glutathione depletion in rhinovirus induction of inflammation in respiratory epithelial cells[J]. J Biol Chem. 2008，283(42)：28595-606.

[12]Abdelwahed A，Bouhlel I，Skandrani I，et al. Study of antimutagenic and antioxidant activities of Gallic acid and 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose from Pistacia lentiscus Confirmation by microarray expression profiling[J]. Chem Biol Interact，2007，165(1)：1-13.

[13]Tetsuya Y，Moriwaki Y J，Yoshihiro F，et al. Effect of TEL-6720，a xanthine oxidase inhibitor，on the nucleoside transport in the lung cancer cell line A549[J]. Pharmacology，2000，60：34-40.

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃(No.2012A163)

朱繼孝，男，副教授，理學(xué)博士。主要從事中藥成分與作用機(jī)理研究工作。E-mail: zhujx81@sina.com

江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心(330004)