血清淀粉酶測定結(jié)果的溯源與方法學(xué)分組的關(guān)系

王衛(wèi)兵

（首都醫(yī)科大學(xué) 產(chǎn)業(yè)經(jīng)營與管理中心，北京 100069）

在一項血清酶測定結(jié)果可溯源性研究中［1］，研究者在市三級醫(yī)院的50家檢驗科或其他臨床實驗室統(tǒng)一發(fā)放由日本臨床化學(xué)協(xié)會（JSCC）推薦的酶參考物（ERM）1支（日本旭化成株式會社生產(chǎn)），各實驗室按現(xiàn)行操作規(guī)程要求進行定標(biāo)（用K值計算時省略此步）和室內(nèi)質(zhì)控測定，再測定ERM，重復(fù)測定10次，在指定日期內(nèi)完成檢測，取均值上報檢驗中心統(tǒng)計計算，統(tǒng)計中一次性排除大于均值±2SD的數(shù)據(jù)。作者對50家ERM的測定結(jié)果均值與ERM標(biāo)示值比較。按研究中采用的實驗方法和統(tǒng)計方法，每個實驗項目用來與標(biāo)示值比較的均值乃是10次測定結(jié)果的均值/每個實驗室×50個實驗室共500個數(shù)據(jù)的均值，并且一次性剔出50個均值中大于均值±2SD數(shù)據(jù)；在測定ERM的同時做了室內(nèi)質(zhì)控，應(yīng)當(dāng)是在控狀態(tài)。有鑒于此，對ERM的測定結(jié)果均值與標(biāo)示值間的相對偏倚屬系統(tǒng)誤差。相對偏倚大的項目之一是淀粉酶（AMY）為負(fù)的16.8%，同時室間變異達29%。作者對此討論指出“AMY實驗室測定結(jié)果CV高達29%，提示可能存在方法學(xué)上的問題”，而對16.8%的系統(tǒng)誤差出現(xiàn)原因未進行討論。我們查對了50家實驗室所用11個不同來源AMY試劑盒主要的測定原理和試劑組成，現(xiàn)就AMY測定結(jié)果溯源性［2］如何科學(xué)合理進行方法分組進行討論。

1 AMY常規(guī)測定方法和試劑盒應(yīng)用現(xiàn)狀

目前在臨床實驗室常規(guī)化驗中使用的AMY試劑盒主要有7個不同來源［3］（見表1）。其中有5個是使用相同底物4，6－亞乙基－（G7）－1，4－對－硝基酚－（G1）－α－麥芽七糖苷（EG7P），其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 EG7P結(jié)構(gòu)式

表1 7種常用AMY試劑盒測定原理、成分比較

但這五家之間所用緩沖液種類有差別其中二家與IFCC推薦法［4］所用緩沖系統(tǒng)相同是HEPES，而另二個分別用Pipes和Goods緩沖液。另一來源的AMY試 劑 盒 用 的 底 物 是 2－氯－4－硝 基 酚－α－麥 芽 三 糖 苷CNPG3），只有一家AMY試劑盒使用的底物是苯甲基－對－硝基酚－麥芽五糖苷（BG5P）。AMY測定方法分組主要依據(jù)即是AMY作用底物結(jié)構(gòu)，不同方法組間存在有統(tǒng)計學(xué)意義的明顯系統(tǒng)誤差。這正是為什么采用這7種不同來源AMY試劑盒檢測ERM的AMY活性會出現(xiàn)如此大的負(fù)偏倚的主要原因。

2 BG5P法與EG7P法之間的系統(tǒng)誤差

日本旭化成株式會社生產(chǎn)的酶校正血清AMY測定采用的底物是對硝基酚－苯甲基－α－麥芽5糖苷（BG5P），JSCC釆用以BG5P（其結(jié)構(gòu)式見圖2）和EG7P為底物的2個方法測定一批血清AMY活性，相關(guān)散點圖見圖3。

圖2 BG5P結(jié)構(gòu)式

圖3 血清AMY活性測定BG5P法與EG7P法相關(guān)散點圖

從圖3可見，用BG5P測出的AMY活性比在EG7P中測出的活性高出約1.67倍。那么，上述研究中50家醫(yī)院臨床實驗室測定旭化成ERM中AMY活性均值為274U/L，ERM標(biāo)示值329U/L，比其高1.20倍，兩者相差55U/L，這應(yīng)是50家參評實驗室釆用不同底物試劑盒與ERM的BG5P之間系統(tǒng)誤差的均值［5］。這是不同方法間客觀存在偏差正常表現(xiàn)，而不能依此作出參評實驗室AMY測定不準(zhǔn)確的結(jié)論。

3 EG7P法與PNPG7法之間的系統(tǒng)誤差

麥芽七糖非還原端不封閉底物1，4—對—硝基酚—（G1）—α—麥芽七糖苷（PNPG7）與EG7P比較，就是因為麥芽七糖苷非還原端被亞乙基封閉，改變了底物結(jié)構(gòu)進而導(dǎo)致AMY與底物之間“誘導(dǎo)契合”相互作用的繼發(fā)改變。二者的酶促反應(yīng)時間曲線見圖4。

圖4 AMY.活性測定2種方法酶促反應(yīng)時間曲線的比較

可見，EG7P法比PNPG7法37℃反應(yīng)延遲時間縮短約2min，線性反應(yīng)圍擴展，在整個測量范圍內(nèi)維持零級反應(yīng)動力學(xué)；但二者測定結(jié)果在3個儀器系統(tǒng)做血清AMY活性平行測定，PNPG7法比EG7P法高［6］，部分實驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 AMY活性測定EG7P（Y）與PNPG7（X）2種方法比較

實驗證明，二者相關(guān)及回歸與溫度無關(guān)，EG7P測定結(jié)果乘以系數(shù)2.5即可轉(zhuǎn)換為心PNPG7結(jié)果，截矩a可略而不計?？梢?，不能籠統(tǒng)地將AMY測定方法分為“麥芽七糖組”。“麥芽七糖組”至少應(yīng)分開3組，即EG7P、BG7P和PNPG7，AMY校正物的選擇應(yīng)用和結(jié)果溯源也應(yīng)按此原則分組進行。

4 EG7P法與其他幾種底物方法的相關(guān)與回歸分析

回歸分析［7］結(jié)果見表中。從表3數(shù)據(jù)可見，因底物結(jié)構(gòu)的差異而導(dǎo)致各方法組間AMY結(jié)果分布在－1.11～3.89U/L之間；b值分布在0.444～1.728之間。此結(jié)果的偏倚、回歸分析表明4種不同底物方法與EG7P方法組比較，a值分組結(jié)果同樣說明AMY的必須科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)進行方法分組，做到“對號入座”、“各就各位”。

表3 EG7P法與其他幾種底物方法的相關(guān)與回歸分結(jié)果

5 討論

影響AMY測定結(jié)果，除底物不同外，還會有其他因素如底物濃度、緩沖液、pH值、離子強度、輔助酶、輔因子的種類和濃度等，試劑盒的性能質(zhì)量、校正方法、儀器性能、儀器分析中的參數(shù)設(shè)置、儀器維護保養(yǎng)、操作規(guī)程等凡構(gòu)成“AMY檢測系統(tǒng)”的各要素中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響到最后的結(jié)果。我們需從“檢測系統(tǒng)”宏觀上去看待每個具體的一個個要素；而在分析一個個具體要素對結(jié)果的影響時，又要依據(jù)“檢測系統(tǒng)”的概念綜合考慮。在AMY“檢測系統(tǒng)”間，影響檢測結(jié)果的主要因素是底物的種類和試劑的配方。在一系列關(guān)于不同檢測系統(tǒng)血清酶測定結(jié)果的偏倚評估與可比性研究中都發(fā)現(xiàn)檢測系統(tǒng)間AMY測定值的系統(tǒng)誤差不能被接受，其原因也應(yīng)按上述思路進行分析［8］。

為了做好血清酶測定結(jié)果的溯源，應(yīng)學(xué)習(xí)IFCC發(fā)布的文件〔PⅡS0009—9120（98）00039—3〕［9］，該文件以實例證明酶校正物的可交換性，只能在有相同分析特異性的方法組內(nèi)進行，一再強調(diào)的是“同方法組”概念。不問酶校正物定值的檢測系統(tǒng)與常規(guī)實驗室檢測系統(tǒng)間是否存在可比性，一律要求在常規(guī)實驗室中將不屬同一檢測系統(tǒng)的結(jié)果硬拉到校正物定值上，這不僅無助于提高酶測定實驗質(zhì)量，相反會造成測定結(jié)果和臨床應(yīng)用的混亂［10］。正如關(guān)于“酶校正物在血清酶測定中的應(yīng)用”［11］一文表明的那樣：一個廠家的校正品一般是在自己的測定系統(tǒng)內(nèi)進行評估的，在同類系統(tǒng)內(nèi)它能很好地把測定結(jié)果的值在參考方法和常規(guī)方法間傳遞，但不一定適合另一個廠家的測定系統(tǒng)，因此不要把一個廠家在特定檢測系統(tǒng)生產(chǎn)的校正品用來校正另一個檢測系統(tǒng)［12］。徐國賓等在分析研究酶校正物定值流程和定值傳遞流程后強調(diào)：“目前臨床化學(xué)在進行血清酶活性濃度測量校準(zhǔn)時張家校準(zhǔn)品張冠李戴的情況應(yīng)該糾正”［13］?？梢?，在酶活性測定結(jié)果可溯源性研究中，不問AMY常規(guī)方法所用底物種類，根據(jù)常規(guī)實驗室用常規(guī)方法測出ERM結(jié)果偏離ERM標(biāo)示值即認(rèn)定常規(guī)方法不準(zhǔn)確是不符合酶活性測定結(jié)果可溯源基礎(chǔ)理論和準(zhǔn)則的。

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