適合于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法探索

王宏剛，徐欣欣，陳成彬，王春國(guó)，陳 力，宋文芹，白艷玲，張金紅，劉 方

（南開(kāi)大學(xué) 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，天津 300071）

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是研究最為深入的細(xì)胞死亡方式之一，在細(xì)胞的生命周期中發(fā)揮著非常重要的生理學(xué)意義［1］。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)已經(jīng)成為普遍使用的方法，被普遍應(yīng)用在藥物的細(xì)胞毒性研究等多個(gè)領(lǐng)域［2－5］。在本科生的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)課程中設(shè)計(jì)“細(xì)胞凋亡的檢測(cè)”實(shí)驗(yàn)，可以幫助學(xué)生系統(tǒng)地學(xué)習(xí)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，掌握處于凋亡過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)及其核酸發(fā)生的變化。檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有很多，但適合本科生基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的方法并不多。目前，針對(duì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的訓(xùn)練也大多在綜合性或開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行［6－8］。探索如何在本科生的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)設(shè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生掌握快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法就顯得尤為重要。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

材料：小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞系（以下簡(jiǎn)稱EL4細(xì)胞）

試劑：1 640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、VP－16、凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、EB、PBS緩沖液、吖啶橙、臺(tái)盼藍(lán)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA梯狀帶電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡

向生長(zhǎng)良好的EL4細(xì)胞中加入終濃度為0.1 mmol/L的 VP－16，繼續(xù)培養(yǎng)36～48h，離心收集細(xì)胞。使用“凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒”提取DNA。1.5%瓊脂糖凝膠低電壓（2～4V/cm）電泳。

2.2 吖啶橙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

向生長(zhǎng)良好的EL4細(xì)胞中加入終濃度為0.1 mmol/L的VP－16，繼續(xù)培養(yǎng)36～48h；取細(xì)胞懸液，滴加0.01%吖啶橙染色液（PBS緩沖液配制）染色5 min；加蓋玻片，在熒光顯微鏡下選用寬譜紫外激發(fā)塊進(jìn)行激發(fā)并觀察細(xì)胞發(fā)出的熒光。

2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

向生長(zhǎng)良好的EL4細(xì)胞中加入終濃度為0.1 mmol/L的VP－16，繼續(xù)培養(yǎng)36～48h；取細(xì)胞懸液，加入2%臺(tái)盼藍(lán)染色液染色2min；加蓋玻片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 DNA梯狀帶電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂。180～200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（見(jiàn)圖1）。

圖1 細(xì)胞凋亡DNA梯狀帶

3.2 啶橙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

吖啶橙可以通過(guò)完整的膜結(jié)構(gòu)使DNA和RNA著色。在熒光顯微鏡下，可觀察到正?；罴?xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)吖啶橙染色后呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。發(fā)生凋亡的細(xì)胞中，核呈黃綠色，斷裂為多個(gè)碎塊狀，碎裂的核由膜包裹著凸起于細(xì)胞表面呈黃綠色（見(jiàn)圖2）。

3.3 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

臺(tái)盼藍(lán)不可以通過(guò)完整的細(xì)胞膜。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，發(fā)生壞死的細(xì)胞呈藍(lán)色。正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞不著色，發(fā)生凋亡的細(xì)胞在細(xì)胞膜上可見(jiàn)凸起的凋亡小泡（見(jiàn)圖3）。

圖2 吖啶橙染色顯示凋亡細(xì)胞（箭頭所示）（400×）

圖3 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡（400×）

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

在設(shè)計(jì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)材料的選擇非常重要。本科生基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)使用的細(xì)胞系應(yīng)該具備培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)較快等特點(diǎn)，以降低培養(yǎng)的難度。如：Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、EL4細(xì)胞等都是比較合適的細(xì)胞株系。選用懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞系可以省去胰酶消化細(xì)胞的步驟，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)潔，提高實(shí)驗(yàn)的成功率。

4.2 誘導(dǎo)方法的選擇

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法有很多種，如紫外線照射、藥物誘導(dǎo)等［9－11］。其中，藥物誘導(dǎo)有著可控性好的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)選擇藥物的濃度和處理時(shí)間可以控制細(xì)胞凋亡的程度，以便在教學(xué)時(shí)能夠向?qū)W生提供合適的實(shí)驗(yàn)材料，幫助學(xué)生觀察細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)的典型特征。

4.3 檢測(cè)方法的選擇

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，基本上分為形態(tài)學(xué)觀察、DNA電泳、蛋白分子的生化檢測(cè)3類［12－13］。本文選擇了具有代表性的DNA梯狀帶電泳、吖啶橙熒光染色法和臺(tái)盼藍(lán)染色法3種實(shí)驗(yàn)方法為本科生開(kāi)設(shè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課。DNA梯狀帶電泳主要是依據(jù)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)DNA在核小體連接處發(fā)生斷裂的特點(diǎn)來(lái)對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行檢測(cè)。吖啶橙熒光染色法和臺(tái)盼藍(lán)染色法根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)形態(tài)的變化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

通過(guò)這3個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)，學(xué)生不但可以直觀地觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的變化，如細(xì)胞核的變形、凋亡小泡的形成等，還可以通過(guò)了解細(xì)胞DNA斷裂的方式理解細(xì)胞程序性死亡的概念。

4.4 教學(xué)的組織

作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，課時(shí)是最重要的一個(gè)限制性因素，需要在固定且較短的時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，這就需要實(shí)驗(yàn)的步驟要盡量簡(jiǎn)潔?；A(chǔ)性實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)的對(duì)象一般為大學(xué)一年級(jí)或二年級(jí)的學(xué)生，要求實(shí)驗(yàn)原理不能太深?yuàn)W，實(shí)驗(yàn)操作不能太復(fù)雜。

相對(duì)于其他檢測(cè)方法而言，吖啶橙熒光染色法和臺(tái)盼藍(lán)染色法的操作復(fù)雜度不高，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均可以在1個(gè)學(xué)時(shí)內(nèi)完成。DNA梯狀帶電泳中涉及到DNA的提取和瓊脂糖電泳技術(shù)。DNA的提取使用試劑盒大約需要1個(gè)學(xué)時(shí)，瓊脂糖電泳大約需要2個(gè)學(xué)時(shí)?？梢栽谶M(jìn)行電泳的同時(shí)，進(jìn)行吖啶橙熒光染色法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)這樣的安排，可以在4個(gè)學(xué)時(shí)內(nèi)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。

5 結(jié)束語(yǔ)

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)是生命科學(xué)類本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的一個(gè)重點(diǎn)，應(yīng)該將這一知識(shí)點(diǎn)的教學(xué)引入基礎(chǔ)性必修實(shí)驗(yàn)課程，使其成為學(xué)生牢固掌握的基本實(shí)驗(yàn)技能之一。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞凋亡相關(guān)的綜合性實(shí)驗(yàn)或科研訓(xùn)練時(shí)的教學(xué)效果會(huì)更好，學(xué)生得到的收獲也會(huì)更多。

（

）

［1］翟中和，王喜忠，丁明孝，等.細(xì)胞生物學(xué)［M］.4版.北京：高等教育出版社，2011.

［2］馮麗，金永哲，劉磊，等.Peroxiredoxin V保護(hù) HT22小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞抵抗NO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37（1）：53－58.

［3］趙夢(mèng)，蔣勇，楊璞，等.呼吸道合胞病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1對(duì)凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制的研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2015，19（1）：60－65.

［4］朱迪，張小天，劉毅，等.鳶尾素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕高糖/高脂誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷［J］.心臟雜志，2015，27（5）：506－509.

［5］李寶霞，張鵬，楊雨虹，等.水飛薊賓聯(lián)合5FU抑制胃癌MGC803細(xì)胞增殖及機(jī)制［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（2）：142－147.

［6］張金紅，劉方，白艷玲，等.生物科學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的探索和實(shí)踐［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2009，26（4）：193－194.

［7］翁秀芳，袁萍，沈關(guān)心，等.“細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與檢測(cè)”整合性實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐與探索［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2013，29（2）：202－204.

［8］李衛(wèi)紅，張海燕，董凌月.五年制基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)熒光雙染法分析細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版，2010，12（增刊2）：74－75.

［9］賈松柏，石晶明，陳翾，等.紫外線對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及Bcl－2，Bax基因的影響［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，37（7）：730－736.

［10］李中東，齊振華，舒義剛，等.G－CSF對(duì)VP16誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡及Survivin mRNA表達(dá)的調(diào)控作用［J］.天津醫(yī)藥，2006，34（10）：682－685.

［11］王琰，陸園園，鮑維維，等.色霉素A2誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（10）：1449－1453.

［12］斯佩特克 D L，戈德曼R D，萊因萬(wàn)德 L A.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南［M］.黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2001.

［13］高超，華子春.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法新進(jìn)展［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（5）：564－569.