研究創(chuàng)新性化學(xué)開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)——鏈霉菌化感活性物質(zhì)的提取與分離

李春遠(yuǎn)，盧其明，陳 敏，羅志剛

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510642）

公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心的基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室每年承擔(dān)資源環(huán)境、生命科學(xué)、園藝、食品科學(xué)、獸醫(yī)、動物科學(xué)、林學(xué)、工程、水利與土木工程、理學(xué)、農(nóng)學(xué)等11個學(xué)院共30多個本科專業(yè)開設(shè)的6門化學(xué)類實(shí)驗(yàn)課程，每年上課學(xué)生超過4 000人，學(xué)生人數(shù)多，教學(xué)層次多樣。所以，從2011年開始，化學(xué)實(shí)驗(yàn)室結(jié)合授課學(xué)生專業(yè)不同特點(diǎn)，提出了“分層次，跨專業(yè)”開放實(shí)驗(yàn)教改思路，即根據(jù)開放對象專業(yè)不同及其與化學(xué)學(xué)科的相關(guān)度進(jìn)行分類，將參與開放實(shí)驗(yàn)的學(xué)生分為非化學(xué)類、農(nóng)科類、理工科類、化學(xué)類等類型，開放教學(xué)內(nèi)容則分為趣味性、基礎(chǔ)性、綜合設(shè)計(jì)性和研究創(chuàng)新性4個教學(xué)層次。教學(xué)中針對不同專業(yè)的學(xué)生，選擇不同的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行分層教育。經(jīng)過數(shù)年的教學(xué)實(shí)踐，該模式取得了良好的教學(xué)效果。

研究創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)教學(xué)強(qiáng)調(diào)學(xué)生的探究和創(chuàng)新，目標(biāo)是培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力、創(chuàng)新意識、合作精神與科學(xué)態(tài)度，是完成高校創(chuàng)新人才培養(yǎng)目標(biāo)的有效途徑。在教學(xué)過程中創(chuàng)立一種類似科學(xué)研究的氛圍，學(xué)生在教師引導(dǎo)下，用類似科學(xué)研究的方式，主動地去進(jìn)行探索、研究、發(fā)現(xiàn)和體驗(yàn)，學(xué)會對信息進(jìn)行收集、對現(xiàn)象進(jìn)行分析和判斷，通過總結(jié)獲取知識，通過研究應(yīng)用知識，從而達(dá)到增強(qiáng)思考能力和創(chuàng)造能力、培養(yǎng)創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力的目的［1－2］?！把芯縿?chuàng)新性教學(xué)”已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家一流大學(xué)推崇的教學(xué)改革模式［3］。

鏈霉菌屬是絕大多數(shù)已知抗生素和一些重要化感活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌［4－8］。在微生物化感活性物質(zhì)研究中，菌株一般要經(jīng)過液體深層發(fā)酵來產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，然后對發(fā)酵液中活性成分進(jìn)行提取、純化再分離出活性物質(zhì)。大孔吸附樹脂具有的低消耗、高效率、高選擇性、后續(xù)處理簡單并且樹脂可再生等優(yōu)勢，其在農(nóng)藥、生化藥物的分離純化以及中成藥的制備等方面［6，9］的應(yīng)用越來越廣泛。把這些新的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)技術(shù)運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中來，讓學(xué)生探索實(shí)驗(yàn)規(guī)律、優(yōu)化反應(yīng)條件、降低化學(xué)實(shí)驗(yàn)室污染的同時，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能、科研創(chuàng)新能力及環(huán)境保護(hù)意識，從而達(dá)到提高教育和教學(xué)質(zhì)量的目的。

1 優(yōu)選實(shí)驗(yàn)教學(xué)材料

微生物中產(chǎn)生抗生素種類和數(shù)量最多的類群是放線菌群，用于植物病害生物防治中的主要是鏈霉菌屬及其相關(guān)類群［10］，其中許多已經(jīng)被開發(fā)成除草劑、殺菌劑和殺蟲劑等［11－12］。作為農(nóng)業(yè)院校，基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)是農(nóng)業(yè)院校最重要的公共基礎(chǔ)課之一，所以開設(shè)一些與農(nóng)業(yè)專業(yè)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有助于學(xué)生以后的專業(yè)學(xué)習(xí)。而從學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)的時效性考慮，鏈霉菌屬成為首選，同時，作為學(xué)生實(shí)驗(yàn)，也不宜采用未研究過的新奇菌株為教學(xué)對象。所以從本實(shí)驗(yàn)室已篩選獲得的具有抑菌及除草活性的放線菌中，選擇了一株對多種病原菌具有強(qiáng)烈抑制作用并對稗草也具有抑制作用的鏈霉菌6803菌株作為研究創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)教學(xué)的材料［13］。

2 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程

“研究創(chuàng)新性教學(xué)”的基本特點(diǎn)之一是主張教學(xué)方法和手段的多樣性，為實(shí)現(xiàn)多元化的教學(xué)目標(biāo)，應(yīng)采用多種教學(xué)方法并充分運(yùn)用現(xiàn)代教育技術(shù)［14］。近年來，一些新的綠色化的實(shí)驗(yàn)方法更多被引進(jìn)到化學(xué)開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)中來，運(yùn)用這些新的實(shí)驗(yàn)方法及新技術(shù)，讓學(xué)生探索實(shí)驗(yàn)規(guī)律，降低化學(xué)實(shí)驗(yàn)室污染，同時也可以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)化學(xué)的興趣。以活性微生物發(fā)酵液為原料，用活性跟蹤的方法測定4種不同極性的大孔吸附樹脂（NAK－II，AB－8，X－5，HP－20）填料對該菌株發(fā)酵液除草活性物質(zhì)的吸附能力，從中篩選最佳的吸附樹脂，并篩選其最佳洗脫劑，提取后的粗提物用制備薄層色譜進(jìn)行分離、純化得到目標(biāo)產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)技術(shù)流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)技術(shù)流程圖

3 優(yōu)選提取、分離及純化方法

3.1 大孔吸附樹脂提取活性物質(zhì)

研究創(chuàng)新性教學(xué)的目的是要增強(qiáng)教學(xué)過程中學(xué)生的主體地位，體現(xiàn)以“學(xué)生發(fā)展”為本的教育思想內(nèi)涵［15－16］。學(xué)生通過查閱大量的相關(guān)資料獲知，在微生物發(fā)酵液農(nóng)用活性物質(zhì)提取研究中，可以采用溶媒萃取，但溶媒萃取需要大量互不相容的溶劑，萃取過程中還可能會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，定量分析回收率低，萃取時間長，消耗溶劑量大。而大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生處理簡單、用少量樹脂就可以處理大量發(fā)酵液等優(yōu)點(diǎn)，而且在提取的同時也有一定的純化作用，該方法克服了液液萃取過程因溶劑揮發(fā)而污染環(huán)境，并且吸附樹脂還可以再生后繼續(xù)使用［17］。

從開放學(xué)生實(shí)驗(yàn)綠色化的角度考慮，決定采用4種不同極性的大孔吸附樹脂（NKA－II、AB－8、X－5、HP－20）對發(fā)酵液的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行提取。發(fā)酵液是教師提前準(zhǔn)備好分發(fā)給各組學(xué)生的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樹脂HP－20對發(fā)酵液的吸附效果最好，樹脂HP－20對發(fā)酵液的靜態(tài)吸附量約可達(dá)到樹脂體積的8倍，用樹脂2～3倍柱體積的80%乙醇—水溶液則可以把吸附的活性物質(zhì)全部從樹脂中解吸出來。該方法既克服了液液萃取過程中溶劑揮發(fā)對環(huán)境的污染，又節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，并且樹脂再生后可以繼續(xù)使用，既節(jié)能又環(huán)保。

3.2 采用超聲波法洗脫目標(biāo)產(chǎn)物

利用超聲波的空化作用加速活性成分的溶出。我們把已經(jīng)被發(fā)酵液吸附飽和的樹脂從層析柱中倒出來，不用以前常規(guī)的方法，而改為把吸附飽和的樹脂置于三角瓶中，然后先用蒸餾水浸泡，再超聲6min，用布氏漏斗抽濾，目的是洗去雜質(zhì)，濾液保留備用；將飽和吸附的樹脂重新轉(zhuǎn)移至三角瓶中，用前面已經(jīng)篩選過的最佳洗脫劑即80%乙醇—水溶液進(jìn)行洗脫。與普通動態(tài)洗脫相比，本方法只用1/3的溶劑即可洗脫出相同的提取量，同時還節(jié)省了大量的時間和能源。本步驟完成后繼續(xù)用蒸餾水對樹脂進(jìn)行洗滌，把乙醇洗干凈，樹脂即可再次循環(huán)使用。對收集的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸餾，在較低的溫度下快速地對樣品進(jìn)行濃縮，收集到的試劑還可以回收再利用。

3.3 制備薄層分離目標(biāo)產(chǎn)物

制備薄層層析原理與柱層析相似，都是利用硅膠吸附性能使得不同物質(zhì)在各種極性溶劑條件下解吸能力差異而進(jìn)行分離純化［18］。制備薄層層析使用購置的薄層板，在開放實(shí)驗(yàn)中提取活性物質(zhì)的量較少的情況下，制備薄層層析的分離效果要優(yōu)于柱層析。引導(dǎo)學(xué)生慢慢地將樣品刷到制備薄層板上，然后在層析缸中慢慢展開，對前面的粗提物進(jìn)行分離，把點(diǎn)好樣的制備薄層板置于展開缸中，比較適合學(xué)生實(shí)驗(yàn)少量樣品的分離純化，展開后用紫外等顯色劑檢驗(yàn)，刮取活性物質(zhì)色譜帶，再上小柱，用少量極性較大的溶劑在色譜柱中把活性物質(zhì)洗脫下來。制備薄層法比柱層析法更加簡便，消耗的溶液量少、時間短且綠色化，在1h內(nèi)，只用150mL試劑即可獲得10mg的7，4’—二羥基黃酮（7，4’—dihydroxyflavone）目標(biāo)產(chǎn)物。

4 用核磁共振譜表征活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)

核磁共振（NMR）儀是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定及化學(xué)反應(yīng)機(jī)理研究等最常用的工具之一［19－20］，學(xué)生首先對薄層制備純化后得到的產(chǎn)物進(jìn)行薄層檢視，選取了斑點(diǎn)單一、純度高的樣品。樣品用真空干燥后，由于比較難溶，所以用DMSO－d6溶劑溶解后裝入核磁管中，用Bruke AV600超導(dǎo)磁核磁共振儀得到NMR的H譜和C譜圖見圖2和圖3，并與文獻(xiàn)［8，21］對照，鑒定該化合物為7，4’—二羥基黃酮（7，4’—dihydroxyflavone）。

學(xué)生通過總結(jié)獲取知識，通過研究應(yīng)用知識，從而達(dá)到增強(qiáng)思考能力和創(chuàng)造能力、培養(yǎng)創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大家集中共同分析實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)的問題并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過程中，有些學(xué)生因?yàn)檠b填料時沒裝密實(shí)，加載發(fā)酵液的時候，吸附樹脂會浮起來。大家熱烈地討論實(shí)驗(yàn)的每一個步驟，交流經(jīng)驗(yàn)，對不滿意的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行重做，直到得出較為滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組的小組長匯集組員的實(shí)驗(yàn)過程資料和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的問題、解決方法及實(shí)驗(yàn)后組員討論的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出實(shí)驗(yàn)存在的問題，把實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理，制作成PPT，大家相互交流，共同提高。大部分的實(shí)驗(yàn)組都能得出較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2 化合物I的1 H－NMR譜

圖3 化合物I的13C－NMR譜

5 結(jié)束語

近幾年來的探索與實(shí)踐證明，“研究創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式能適應(yīng)當(dāng)前教學(xué)改革的要求，能激勵學(xué)生的求知愿望，能激發(fā)學(xué)生的成就感與創(chuàng)新欲望，有利于提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能、科研意思和科研能力。近年來，學(xué)生獲得多項(xiàng)國家級、省級及校級的獎勵。下一步將積極配合學(xué)校實(shí)踐教學(xué)改革，將重點(diǎn)放在學(xué)生科研能力的培養(yǎng)上，充分激發(fā)學(xué)生的科學(xué)激情，并隨時根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)教學(xué)方式，真正做到對學(xué)生的科學(xué)意識、科研能力及創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。

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