反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大鼠血清中多索茶堿和甲潑尼龍的質(zhì)量濃度*

陳 菲，王建美，盛柳青，裘穎兒

（1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321000； 2.浙江省金華食品藥品檢驗(yàn)所，浙江 金華 321000）

慢性阻塞性肺疾病是老年患者呼吸道的常見病和多發(fā)病，患病率和病死率均高，世界衛(wèi)生組織報(bào)告其占全球所有疾病死因的第4位，每年大約有270萬(wàn)人死于該病，我國(guó)為128萬(wàn)［1-2］。多索茶堿和甲潑尼龍是臨床常用的治療慢性阻塞性肺疾病發(fā)作的藥物。多索茶堿是一種具有抗炎和支氣管擴(kuò)張作用的新一代甲基黃嘌呤衍生物，可通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)的磷酸二酯酶發(fā)揮松弛支氣管平滑肌的作用；甲潑尼龍是人工合成的中效糖皮質(zhì)激素，具有較強(qiáng)的抗炎活性且在肺部的血藥濃度較高，能減輕患者急性炎癥和氣道阻塞；早期聯(lián)合使用這兩種作用機(jī)制不同的藥物，可有效控制慢性阻塞性肺疾病的各種癥狀［3-4］。多索茶堿的代謝受多種因素及藥物的影響，甲潑尼龍作為激素類藥物與多種藥物存在相互作用的可能，而兩者作為臨床常見的聯(lián)用藥物，其藥代動(dòng)力學(xué)、相互作用卻未見文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)中以大鼠為研究對(duì)象，針對(duì)兩者理化性質(zhì)差異較大的特點(diǎn)，以氫化可的松為內(nèi)標(biāo)，采用單一流動(dòng)相，建立了可同時(shí)測(cè)定兩者血藥濃度的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥、動(dòng)物

Waters2487型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），2487紫外檢測(cè)器，Breeze色譜工作站，20μL自動(dòng)進(jìn)樣閥；WH-90A型微型旋渦混合器（上海振榮科學(xué)儀器有限公司）；TDL80-2型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）；1004型電子天平（上海天平儀器廠）；ACS-3型電子計(jì)價(jià)秤（金華市征龍衡器有限公司）。多索茶堿對(duì)照品（批號(hào)為100625-201202），甲潑尼龍對(duì)照品（批號(hào)為100828-200501），氫化可的松對(duì)照品（批號(hào)為 100152-200206），均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；水為重蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重250～300 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物試驗(yàn)許可證號(hào)為SCXK＜浙＞20140001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（150mm ×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.5% 醋酸溶液（54 ∶46）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0mL /min；進(jìn)樣量：20 μL；內(nèi)標(biāo)物：氫化可的松。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密稱取多索茶堿25mg和甲潑尼龍15mg，加甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，得含質(zhì)量濃度為1.0 g/L及0.6 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密稱取氫化可的松10mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶，得質(zhì)量濃度1.0 g/L的內(nèi)標(biāo)貯備液。將多索茶堿和甲潑尼龍標(biāo)準(zhǔn)貯備液用甲醇梯度稀釋為質(zhì)量濃度分別為400，200，100，50，20，10，5 μg /mL 和 240，120，60，30，12，6，3 μg /mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血清樣品處理［5］

采集大鼠空白血液，置未加抗凝劑的離心管中，3 000 r/min低溫離心5min，分離得空白血清。精密量取空白血清1.0mL，加1.0 g/L的內(nèi)標(biāo)貯備液50μL，用甲醇稀釋至5.0 mL，渦旋混合1min，4 000 r/min離心15min，取上清液過(guò)濾，得血清樣品。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按擬訂色譜條件，取大鼠空白血清、空白血清+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)溶液，依法測(cè)定。結(jié)果多索茶堿、甲潑尼龍和氫化可的松的保留時(shí)間分別為3.761，22.099，13.177min，三者分離良好，且血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待測(cè)物出峰也不造成干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取空白血清1.0mL，加入多索茶堿和甲潑尼龍的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5mL，按2.3項(xiàng)下方法操作得不同質(zhì)量濃度（含多索茶堿 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μg /mL和甲潑尼龍 0.3，0.6，1.2，3.0，6.0，12.0，24.0 μg /mL）的血清對(duì)照品共7份。按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，分別以待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值（Y）對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸。得多索茶堿的回歸方程 Y＝0.109 4X+0.005 3，r＝0.999 5；甲潑尼龍的回歸方程 Y＝0.175 2X-0.037 2，r＝0.9996。結(jié)果表明，多索茶堿和甲潑尼龍質(zhì)量濃度在0.5～40μg/mL和0.3～24μg/mL（n＝7）范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：在空白血清中加入一定量的待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)血清樣品（含多索茶堿和甲潑尼龍分別為 30.0，7.5，1.0 μg/mL 和 20.0，5.0，0.5μg/mL）各5份，按2.3項(xiàng)下方法操作。在24 h內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1，日內(nèi)和日間 RSD均小于10%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取血清樣品，在室溫放置6 h，或經(jīng)過(guò)3個(gè)冷凍-解凍循環(huán)，或-20℃條件下冷凍保存1個(gè)月。以待測(cè)物測(cè)定的質(zhì)量濃度與實(shí)際質(zhì)量濃度之間的 RSD作為考察指標(biāo)，其 RSD分別為5.52%，7.13%，4.89%（n＝5），表明處理過(guò)的血清樣品具有良好的穩(wěn)定性，血清樣品凍融3次和冷藏1個(gè)月基本保持穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：制備含多索茶堿和甲潑尼龍質(zhì)量濃度分別為10μg/mL和 6μg/mL的血清樣品 6份，分別加入多索茶堿（400 μg/mL）和甲潑尼龍（240 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液 100，125，150 μL，平行測(cè)定2份，按2.3項(xiàng)下方法操作，計(jì)算加樣回收率［6-7］。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

對(duì)于同時(shí)測(cè)定理化性質(zhì)差異較大的藥物，文獻(xiàn)報(bào)道多集中在采用HPLC梯度洗脫，或采用2種流動(dòng)相分別洗脫［8-9］，而本方法只采用單種流動(dòng)相洗脫，從方法上來(lái)說(shuō)更簡(jiǎn)便快速。本方法的建立，不僅為研究多索茶堿和甲潑尼龍的藥代動(dòng)力學(xué)、藥物相互作用提供了技術(shù)基礎(chǔ)，也為建立同時(shí)檢測(cè)其他理化性質(zhì)存在較大差異的聯(lián)用藥物的血藥濃度方法提供了參考。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：對(duì)多索茶堿和甲潑尼龍的甲醇溶液在200～400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)多索茶堿在272nm、甲潑尼龍?jiān)?43 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。綜合考慮2個(gè)待測(cè)物的靈敏度、內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)和血清內(nèi)源性雜質(zhì)等影響因素，最終選定260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相的選擇：對(duì)甲醇-水系統(tǒng)與乙腈等其他試劑進(jìn)行比較，因甲醇廉價(jià)易得且安全性較高，對(duì)儀器以及色譜柱損害程度小，選擇前者；結(jié)合多索茶堿和甲潑尼龍的極性相差較大因素，在甲醇∶水（30%→70% ∶70%→30%）范圍內(nèi)試驗(yàn)，進(jìn)行加酸篩選，最后選定甲醇-0.5%醋酸溶液（54∶46）為流動(dòng)相。

內(nèi)標(biāo)物的選擇：因生物樣品的藥物濃度低，故采用內(nèi)標(biāo)法。本試驗(yàn)中對(duì)咖啡因、地塞米松、氫化可的松、苯巴比妥、非那西丁、炔諾酮等候選內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行了篩選［10］，最后選定保留時(shí)間剛好在2種待測(cè)物之間、分離良好且在檢測(cè)波長(zhǎng)處響應(yīng)較好的氫化可的松作為內(nèi)標(biāo)物。

生物樣品的選擇：對(duì)空白血漿和空白血清的色譜圖進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)空白血漿的內(nèi)源性雜質(zhì)比空白血清多，特別是在保留時(shí)間為5.5min時(shí)附近有一較強(qiáng)的吸收峰，且與多索茶堿的吸收峰較為接近，因此選擇內(nèi)源性干擾較少的空白血清作為生物樣品。

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