DD3 mRNA及DD3 mRNA/D定量檢測對前列腺特異性抗原灰區(qū)前列腺癌診斷的臨床價值

李慧峰，吳振啟，劉敏，陳磐，陳瑛，郭劍明

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論著·臨床

DD3mRNA及DD3mRNA/D定量檢測對前列腺特異性抗原灰區(qū)前列腺癌診斷的臨床價值

李慧峰，吳振啟，劉敏，陳磐，陳瑛，郭劍明

目的 研究前列腺組織中DD3mRNA及DD3mRNA/D定量檢測在前列腺特異性抗原(PSA)灰區(qū)前列腺癌臨床診斷中的應用價值。方法 選擇sPSA4～10ng/ml的前列腺增生(BPH)患者112例和前列腺癌(PC)患者25例，進行RT-PCR、PSA檢測、B型超聲檢查及前列腺穿刺活檢。觀察其DD3mRNA、DD3mRNA/D、血清PSA(sPSA)、前列腺穿刺活檢標本PSA(uPSA)、總PSA/游離PSA比值(f/tPSA)、s/uPSA、PSA密度(PSAD)等參數(shù)的差異,并應用ROC曲線分析各參數(shù)的診斷價值。結果 2組患者年齡、前列腺體積比較差異無統(tǒng)計學意義(t=12.87、12.31,P>0.05)；tPSA、PSAD比較差異均有統(tǒng)計學意義(t=7.31、6.89,P<0.05)；PC組DD3mRNA/PSAmRNA比值明顯高于BPH組(t=7.86,P=0.009)；PC組DD3mRNA/D比值明顯高于BPH組(t=7.28,P=0.05)。ROC曲線分析結果表明，以0.27為截斷值，DD3mRNA/PSAmRNA的曲線下面積為0.841(95%CI0.666～0.997)；以2.01為截斷值，DD3mRNA/D的曲線下面積為0.907(95%CI0.790～0.869)。結論DD3mRNA含量、DD3mRNA/D定量檢測可以顯著提高檢出PSA灰區(qū)前列腺癌的敏感度，對PSA灰區(qū)前列腺癌的早期篩查診斷意義重大，DD3mRNA/D具有更好的診斷效能。

前列腺特異性抗原;灰區(qū)前列腺癌；DD3mRNA/D；DD3mRNA

在西方國家前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性最常見的腫瘤,我國發(fā)病率近年來也呈迅速上升趨勢[1～3]。前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA) 產生于前列腺上皮細胞,在前列腺腺體的腺泡和腺管上皮細胞內合成,直接分泌于前列腺導管系統(tǒng)[4]。血清PSA(serum PSA,sPSA) 是前列腺癌篩查的常用指標,但是良性前列腺增生癥(BPH)、前列腺炎、急性尿潴留(AUR )以及有關前列腺的各種檢查(DRE、TRUS)等均可引起PSA 水平升高[5，6]。血清總PSA(total PSA,tPSA)>4 ng /ml 時,前列腺穿刺活檢陽性率只有1/3,但在臨床應用中，當sPSA在4～10 ng/ml的范圍,此時難以根據(jù)sPSA水平來區(qū)分前列腺癌和BPH,故該區(qū)域稱為PSA灰區(qū)[7]。

國內外學者應用tPSA與游離PSA(free PSA,fPSA)比值( f/ tPSA )、sPSA 與前列腺穿刺活檢標本PSA (urine PSA,uPSA)比值(s/uPSA)、前列腺特異性抗原密度(PSA density,PSAD)等參數(shù)篩查PSA灰區(qū)的前列腺癌，但特異性仍不十分理想[8]。

所以尋找更特異的PC標志物已成為研究的熱點。DD3(differential display code 3)是一種前列腺高特異性的非編碼RNA。DD3 在前列腺癌標本及前列腺癌轉移灶中均有高表達。Northern Blot分析顯示DD3高度特異性地表達于前列腺癌細胞,在其他正常組織、腫瘤組織和大量的細胞系中均不表達,被認為是前列腺癌最特異的一種基因。

檢測前列腺活檢標本中DD3 mRNA和/或DD3 mRNA/D(密度)是否能對PSA灰區(qū)前列腺癌有更特異性診斷價值和更高的靈敏度呢？現(xiàn)選擇sPSA在4～10 ng/ml 的BPH 或前列腺癌患者137例,觀察其前列腺穿刺活檢標本中DD3 mRNA、DD3 mRNA/D、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等參數(shù)的差異,并應用ROC曲線分析各參數(shù)的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年7月—2014年6月復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科和復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院泌尿外科門診及住院患者137例,納入標準：sPSA水平在4～10 ng/ml，3個月內未行糖皮質激素治療，近2周未行尿道器械檢查及經(jīng)直腸操作等篩選。根據(jù)穿刺或術后病理活組織檢查(活檢) 結果分為BPH組和PC組。BPH組112例，年齡63～76(69.6±6.8)歲，病程0～17(8.6±8.5)年,其中合并高血壓病33例，糖尿病15例，膀胱結石3例，無明顯誘因。PC組25例，年齡67～78(72.4±5.7)歲，病程0～16(8.3±7.2)年,合并高血壓病9例，糖尿病3例，膀胱結石1例，腦梗死病史2例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意并簽署同意書。

1.2 觀測指標 觀察2組患者DD3 mRNA、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等參數(shù)的差異,并應用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析各參數(shù)的診斷價值。ROC曲線是用不同的二分類方式(分界值或決定閾)，以真陽性率(靈敏度)為縱坐標，假陽性率(1-特異度)為橫坐標繪制的曲線[8]。本研究中ROC計算公式參照文獻[9]，分析DD3mRNA、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等參數(shù)與臨床標準診斷結果之間的異同。該方法可根據(jù)實際情況，允許有中間狀態(tài)，可以把試驗結果劃分為多個有序分類，如正常、大致正常、可疑、大致異常和異常5個等級再進行統(tǒng)計分析。該方法可以提供DD3mRNA、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等參數(shù)任意界限值時的對前列腺癌的識別能力。調節(jié)基線(base line)至適宜處,各熒光曲線與基線的交叉點即為Ct(cycle threshold)值,根據(jù)標準曲線上的濃度與Ct值的對應關系,可求出各待測標本的初始濃度。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本收集： 137例患者均于清晨采集空腹肘靜脈血2 ml,15 min內分離血清并置于-20℃保存;并行前列腺活檢，活檢組織-70℃保存。

1.3.2 DD3 mRNA含量測定： (1)RNA抽提：按照經(jīng)典總RNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA后真空干燥。用焦碳酸二乙酯(DEPC)15 μl水溶解。取RNA液2 μl加入水98 μl混勻后在DU800型紫外分光光度儀(北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司)上測定A260/A280比值(RNA質量檢測)及RNA含量，RNA樣品完整性用1%甲醛變性凝膠電泳鑒定。(2)RT-PCR檢測:①互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成：取RNA模板樣品11 μl,加入O-ligo(dT)0.5 μg /1 μl，具體操作按逆轉錄試劑盒說明書進行,總反應體積20 μl，最后取2 μl產物用于PCR擴增。②DD3 mRNA 的擴增: 在外顯子1和3之間設計一對DD3引物和一條MGB探針。20 μl反應體系中含有上游引物300 nmol/L,下游引物900 nmol/L,MGB探針200 nmol/L,cDNA 2μl，Universal Master Mix (Applied Biosystems)10 μl。③PCR擴增條件: 首先95℃10 min熱啟動Taq酶,再進行兩步法循環(huán)擴增:92℃10 s、60℃30 s共50個循環(huán)。

1.3.3 PSA檢測： 采用瑞典康乃格診斷公司的 CanAg PSA EIA 340210與CanAg Free PSA EIA 350210試劑盒,按說明書應用化學發(fā)光法測定血清標本的tPSA (即sPSA)、fPSA及尿標本的uPSA,計算f/tPSA、s/uPSA[10]。

1.3.4 前列腺體積測定[11]： 使用彩色多普勒超聲診斷儀經(jīng)直腸超聲(transrectal ultrasound,TRUS)測定前列腺左右徑(D1)、上下徑(D2)及前后徑(D3),計算前列腺體積(V= D1×D2×D3×0.52)、PSAD(PSAD=tPSA/V)及DD3 mRNA密度。

2 結 果

2.1 臨床檢測指標比較 2組患者的年齡、前列腺體積比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而tPSA、PSAD比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組臨床檢測指標比較 (±s)

2.2DD3mRNA含量及密度比較 與BPH組比較，PC組DD3mRNA、DD3mRNA/D比值均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 2組DD3 mRNA含量及密度的比較 (±s)

2.3DD3mRNA診斷PC性能評價 經(jīng)ROC曲線分析：(1)將截斷值定為0.27，DD3mRNA/PSAmRNA比值的曲線下面積為0.841(95%CI0.666～0.997)。PC組中有22例高于此截斷值，DD3mRNA/PSAmRNA比值的靈敏度為86.5%。BPH組中有25例高于此截斷值，其特異度為76.8%。陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)分別為75.5%、87.8%，準確度為81.5%。(2)將截斷值定為2.01，前列腺穿刺活檢標本DD3mRNA/D比值診斷PC的曲線下面積為0.907(95%CI0.790～0.869)。PC組中有23例高于此截斷值，DD3mRNA/D比值的靈敏度為93.3%，BPH組中有37例高于此截斷值，其特異度為66.7%。陽性預測值、陰性預測值分別為69.2%、92.5%，準確度為78.5%。結果顯示，DD3mRNA/D的檢驗效能更大。見表3、圖1。

表3 DD3 mRNA/PSA mRNA、DD3 mRNA/D檢測診斷PC的效能比較 (%)

圖1 DD3 mRNA/PSA mRNA和DD3 mRNA/D的ROC曲線

3 討 論

PSA篩查導致前列腺癌診斷時分期有了巨大變化，進展期患者發(fā)病率下降[7]。盡管PSA在前列腺癌早期診斷上的作用被肯定，但這種標志物也易出現(xiàn)假陽性，PSA異常人群中約75%活檢未發(fā)現(xiàn)癌，在PSA<10ng/m1時特異性差，陽性預測值低，尤其是PSA灰區(qū)(4～10ng/ml)在臨床分析中不能被忽視[8]。盡管有關PSA的研究取得很多進展，包括f/tPSA、PSAD等參數(shù)的應用減少了前列腺增生和前列腺炎引起的假陽性，但在前列腺癌診斷特異性上取得的進展有限[9]。經(jīng)典分子標志物PSA的局限性需要尋找新的分子標志物，使之不僅能準確地發(fā)現(xiàn)前列腺惡性病變，而且能夠區(qū)分低級別的腺性前列腺癌[10～12]。其他生物標本如前列腺按摩后收集的尿液，通過檢測分子標志物如DD3已證明在前列腺癌臨床診斷和預后分析上有一定價值[13，14]。

DD3基因是1999年Bussemakers等發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異基因，它是一種非編碼RNA[15]。通過Northernblot法分析發(fā)現(xiàn)，該基因在前列腺癌細胞有特異性表達，而在正常前列腺細胞、前列腺增生的細胞中不表達或者僅少量表達，在其他腫瘤組織中不表達。與PSA基因相比，DD3基因是一個前列腺癌特異性很強的基因[15，16]。研究發(fā)現(xiàn)，與良性組織相比，前列腺癌組織中DD3的含量增加了34倍，即使組織中前列腺癌細胞的含量較少(≤10%)，DD3也能夠清晰準確地表達。運用實時定量的RT-PCR技術，能準確量化地檢測DD3，具有診斷前列腺癌和判斷其預后的價值[17]。

本研究選擇137例血清tPSA在4～10ng/ml的BPH或PC患者,進行前列腺穿刺活檢，用熒光實時定量RT-PCR方法檢測DD3mRNA含量并計算其密度。由于不同的標本中含有前列腺細胞數(shù)量不一樣，每微克RNA所含前列腺細胞的比例也不同，需要用管家基因對其校正，而PSA在正常前列腺細胞中的表達較恒定，在PC細胞中也僅有輕微下降。故本研究選擇PSAmRNA作為前列腺細胞中的“管家基因”來校正前列腺穿刺活檢標本中的前列腺細胞數(shù)，以消除不同標本之間前列腺細胞數(shù)的差異對實驗結果的影響，使相對定量結果更可靠[6，18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PC患者前列腺穿刺活檢標本中DD3mRNA相對定量值(0.36±0.21)與BPH患者(0.12±0.18)相比，差異顯著(P=0.009)，DD3mRNA/D比值也顯著高于BPH患者(P=0.005)。該結果和胡存利等[18，19]的研究相一致。本文研究結果說明，在綜合考慮靈敏度和特異度的情況下，DD3mRNA/D比值在鑒別和診斷PSA灰區(qū)前列腺良性增生患者和前列腺癌方面的效能更強。因此，DD3mRNA/D比值可以在PSA灰區(qū)前列腺癌的篩檢和早期鑒別診斷中發(fā)揮作用。

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Quantitative detection of DD3 mRNA and DD3 mRNA/D in patients with early clinical diagnosis of prostate cancer with PSA in diagnostic gray zone

LIHuifeng,WUZhenqi,LIUMin,CHENPan,CHENYing,GUOJianming.DepartmentofUrology,ZhongshanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,QingpuBranch,Shanghai201700,China

WUZhenqi,E-mail:wzq0719@hotmail.com

Objective To study the expression of DD3 mRNA and DD3 mRNA/D in the diagnosis of prostate cancer in PSA gray zone.Methods One hundred and twelve patients with sPSA 4-10 ng / ml of benign prostatic hyperplasia (BPH) and 25 cases of prostate cancer (PC) were enrolled, RT-PCR and PSA were test, B type ultrasonography and biopsy of prostate were performed. Observed the difference of the DD3 mRNA, DD3 mRNA/D, serum PSA(sPSA), prostate puncture biopsy specimens of PSA (uPSA), total / free PSA ratio (f/ tPSA), s/uPSA, PSA density (PSAD) etc. parameters, and used ROC curve to analyze the diagnostic value of each parameter.Results Two groups’ patients’ age, prostate volume showed no statistical significance differences (t=12.87,t=12.31,P>0.05);TPSA,PSAD’sdifferenceshowedstatisticssignificance(t=7.31,t=6.89,P<0.05);PCgroup’sDD3mRNA/PSAmRNAratioweresignificantlyhigherthanthatofBPHgroup(t=7.86,P=0.009);PCgroup’sDD3mRNA/DratiosignificantlyhigherthanBPHgroup(t=7.28,P=0.05).ROCcurveanalysisshowedthatwhencut-offvaluewas0.27,theDD3mRNA/PSAmRNA’scurveareawas0.841 (95%CI0.666-0.997);whencutoffvaluewas2.01,thecurveareaofDD3mRNA/Dwas0.907 (95%CI0.790-0.869).Conclusion DD3 mRNA content and quantitative DD3 mRNA/D detection can significantly improve the detection sensitivity of the PSA gray zone prostate cancer, has great significance for PSA gray zone prostate cancer early screening and DD3 mRNA/D has better diagnostic efficiency.

Prostate specific antigen; Gray zone prostate cancer; DD3 mRNA/D; DD3 mRNA

上海市青浦區(qū)科學技術發(fā)展基金項目(No.2011-38)

201700 上海，復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院泌尿外科

吳振啟，E-mail:wzq0719@hotmail.com

2015-02-26)

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.07.017