炒酸棗仁對地西泮誘導的睡眠及宿醉效應的影響

葉曉楠，向甜甜，王艷艷，黃莉莉，華伊，吳傳芳，李廷利*（.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 50040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 50040）

隨著生活節(jié)奏的加快，失眠的患病率也在逐年攀升。在我國，符合失眠癥診斷標準的患者約占15%[1]，嚴重失眠的患者其病程可達十年之久[2]。目前，藥物治療是臨床上治療失眠的主要方法之一，一線藥物以具有鎮(zhèn)靜催眠作用的化學藥物為主，根據(jù)化學結構和受體作用位點的不同，鎮(zhèn)靜催眠藥可分為巴比妥類、苯二氮?類、非苯二氮?類、褪黑素受體激動劑以及一些具有催眠效果的抗組胺藥、抗抑郁藥等。苯二氮?類藥物短期對癥療效確切，但用藥后常伴有嗜睡、頭昏以及反跳性失眠等不良反應，大劑量使用可見共濟失調，長期應用還會出現(xiàn)認知障礙、甚至是蓄積中毒，因此人們迫切希望有更加安全有效的藥物或是對現(xiàn)有藥物具有增效減毒作用的藥物出現(xiàn)。

宿醉是指服用傳統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠藥（苯二氮?類）次日出現(xiàn)的頭暈、困倦、精神不振等現(xiàn)象[3]，系由藥物半衰期長、在體內代謝緩慢所致。研究表明，合理配伍中藥可以有效降低宿醉反應[4-5]。酸棗仁是鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子[6]，始記載于《神農本草經(jīng)》，醫(yī)籍初見于《傷寒雜病論》[7]。其味甘、酸，平，歸肝、膽、心經(jīng)，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津之功。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中具有生物活性的物質高達50多種[8]，近些年來有關于酸棗仁改善睡眠的研究較為深入，其中已經(jīng)明確皂苷類、生物堿類和黃酮類物質具有改善睡眠的作用[9]，其作用機制可能與調節(jié)細胞因子[10]、單胺類神經(jīng)遞質、氨基酸類神經(jīng)遞質水平有關[11]，但是目前在中西醫(yī)結合領域關于酸棗仁是否具有協(xié)同增強傳統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠類藥物的催眠作用以及是否能降低該類藥物不良反應的研究鮮有報道。因此本文針對上述問題，選擇了臨床常用的苯二氮?類長半衰期藥物地西泮來研究酸棗仁對其增效減毒作用，為豐富酸棗仁的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質量（20±2）g [黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（黑）2013-004]。飼養(yǎng)在溫度（24±2）℃，濕度50%～60%，12 h明暗交替（光照時間7：00～19：00，光照強度300 Lux）的環(huán)境中，適應性喂養(yǎng)7 d，期間自由攝取食物和水。

1.2 試藥

酸棗仁[山西振東道地藥材開發(fā)有限公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子]。地西泮注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1605291，規(guī)格：10 mg/2 mL）。

1.3 儀器

ME204電子分析天平（上海梅特勒-托利多）；ZZ-6型小鼠自主活動測試儀（上海益聯(lián)醫(yī)學儀器發(fā)展有限公司）；小鼠高架十字迷宮（自制。黑色木質；中央平臺：5 cm×5 cm；臂長×寬：30 cm×5 cm；閉臂高度：15 cm）。

2 方法

2.1 炒酸棗仁凍干粉的制備

參照耿欣等[12]優(yōu)化的方法進行酸棗仁的炮制。將炮制后的230 g酸棗仁粉碎，取適量粗粉加入8倍量的蒸餾水，浸泡30 min，加熱至沸騰后煎煮80 min，16層紗布過濾，冷凍干燥，得凍干粉30 g，密封保存。使用前取炒棗仁凍干粉26 g，加蒸餾水溶解，定容至50 mL，即得相當于生藥量4 g·mL－1的炒酸棗仁凍干粉溶液。

2.2 地西泮誘導小鼠睡眠的最小有效劑量的研究

選取120只雄性ICR小鼠隨機分為空白組和地西泮注射液不同劑量（5.2、10.4、15.6、20.8、41.6 mg·kg－1）組，每組20只。實驗前所有動物禁食不禁水12 h，地西泮注射液組小鼠分別經(jīng)腹腔注射給予相應劑量的地西泮注射液，空白組經(jīng)腹腔注射給予等體積的0.9%NaCl溶液。注射后開始觀察并計時，以小鼠翻正反射消失為指標，記錄30 min內小鼠翻正反射消失達1 min以上的小鼠數(shù)量及小鼠睡眠時間（翻正反射消失的持續(xù)時間），并計算入睡率，入睡率（%）＝入睡小鼠數(shù)量/該組小鼠總數(shù)×100%。

2.3 炒酸棗仁對地西泮催眠的協(xié)同作用的研究

選取36只雄性ICR小鼠，隨機分為空白組、地西泮組和炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組，每組12只。炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組小鼠經(jīng)灌胃途徑給予炒酸棗仁80 g·kg－1[4]，空白組和地西泮組給予同體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后30 min，地西泮組和炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組經(jīng)腹腔注射地西泮注射液20.8 mg·kg－1，空白組注射等體積的0.9%NaCl溶液。觀察記錄小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間。

2.4 炒酸棗仁對地西泮宿醉效應的影響

2.4.1 小鼠自主活動實驗 在翻正反射恢復30 min后，將“2.3”項下的小鼠放入小鼠自主活動測量儀，先在儀器內適應環(huán)境5 min，記錄隨后5 min內的小鼠站立次數(shù)和活動次數(shù)。實驗結束后，用醋酸水溶液擦拭箱體，以消除上只動物的氣味對后續(xù)實驗動物的影響。

2.4.2 小鼠高架十字迷宮實驗 在完成自主活動實驗測試后5 min，將小鼠頭朝一側開臂，放入高架十字迷宮中央?yún)^(qū)，讓小鼠自由探索迷宮5 min，實驗結束后，用醋酸水溶液擦拭迷宮，以消除上只動物的氣味對后續(xù)實驗動物的影響。通過視頻記錄分析5 min內小鼠開放臂停留時間、開放臂進入次數(shù)、閉臂停留時間、閉臂進入次數(shù)。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用χ2和Fisher精確檢驗。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，用LSD法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 地西泮誘導小鼠睡眠的最小有效劑量

在睡眠時間上，與空白組相比，地西泮10.4、15.6、20.8、41.6 mg·kg－1組小鼠的睡眠時間明顯增加（P＜0.01）；在入睡率上，地西泮5.2 mg·kg－1組小鼠未進入睡眠，但觀察顯示小鼠活動明顯減少；地西泮10.4 mg·kg－1組小鼠僅有個別動物進入睡眠；與空白組比較，地西泮15.6、20.8和41.6 mg·kg－1組的小鼠入睡率均增加（P＜0.01），在20.8 mg·kg－1小鼠入睡率達到100%，因此在本研究后續(xù)實驗中采用20.8 mg·kg－1的地西泮誘導小鼠睡眠。實驗結果見圖1。

圖1 地西泮誘導小鼠睡眠的最小有效劑量的研究 Fig 1 Minimum effective dose of diazepam on sedative and hypnotic effect in mice

3.2 炒酸棗仁對地西泮催眠的協(xié)同作用

與地西泮組小鼠相比，炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組小鼠的睡眠持續(xù)時間增加（P＜0.05），睡眠潛伏期未見明顯變化（P＞0.05）。結果見表1。

表1 炒酸棗仁對地西泮催眠小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間的影響(±s，n＝20) Tab 1 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on sleep latency and sleep duration of mice induced by diazepam (±s，n＝20)

表1 炒酸棗仁對地西泮催眠小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間的影響(±s，n＝20) Tab 1 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on sleep latency and sleep duration of mice induced by diazepam (±s，n＝20)

注（Note）：與地西泮組比較，#P＜0.05（Compared with the diazepam group，#P＜0.05）。

組別 睡眠潛伏期/min 睡眠持續(xù)時間/min空白組 － －地西泮組 2.46±1.25 67.57±18.73炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組 2.37±0.67 83.17±18.68#

3.3 炒酸棗仁對地西泮所致宿醉效應的影響

3.3.1 小鼠自主活動實驗結果 與空白組相比，地西泮組小鼠自主活動次數(shù)、站立次數(shù)均減少（P＜0.01）。與地西泮組相比，炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組小鼠的自主活動次數(shù)、站立次數(shù)均增加（P＜0.01）。實驗結果見圖2。

圖2 炒酸棗仁對地西泮所致宿醉小鼠自主活動的影響Fig 2 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on locomotion activity of diazepam-induced hangover in mice

3.3.2 小鼠高架十字迷宮實驗結果 與空白組相比，地西泮組與炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組小鼠開放臂停留時間明顯增多（P＜0.01），在閉臂停留時間及閉臂進入次數(shù)明顯減少（P＜0.01），與地西泮組相比，炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組小鼠在開放臂進入次數(shù)及閉臂進入次數(shù)明顯增多（P＜0.01，P＜0.05）。實驗結果見圖3。

圖3 炒酸棗仁對地西泮所致宿醉小鼠在高架十字迷宮行為的影響Fig 3 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on EPM behavior of diazepam-induced hangover in mice

4 討論

失眠癥的治療方法主要包括心理治療、藥物治療和物理治療[13]，苯二氮?受體激動劑是藥物療法的首選藥物，該類藥物短期應用療效確切，但不良反應較多。宿醉效應是地西泮最常見的不良反應之一[14-15]，是指患者在服藥次日晨起出現(xiàn)的頭暈、困倦、精神不振，如同“醉酒醒來”的現(xiàn)象，嚴重影響了患者日間的工作效率和正常生活。研究表明，宿醉的發(fā)生主要和藥物半衰期有關，而遺傳因素、年齡和性別因素、妊娠因素及藥物的協(xié)同作用因素[16]均可對藥物在體內的清除速率產(chǎn)生影響。酸棗仁為安神類中藥臨床應用的首選，其用于改善睡眠從漢末便有記載[17]。自宋代有了酸棗仁炮制品開始，出現(xiàn)了酸棗仁“生熟異治”的藥效之說，宋《太平圣惠方》載“膽虛不眠寒也，酸棗仁炒香”[18]；明《本草綱目》曰“睡多生使，不得睡炒熟”[19]，考證醫(yī)學古籍發(fā)現(xiàn)生酸棗仁與炒酸棗仁的功效存在差異，治療“失眠”多用炒品[20-21]，且炮制領域一直有著“逢子必炒”[22]的理論，因此本文使用的是炒酸棗仁。近代也有許多學者圍繞酸棗仁開展了主要化學成分的研究[23]，和其對改善睡眠的作用[24]及作用機制[25-26]進行的藥理學研究，但對于酸棗仁聯(lián)合地西泮使用治療失眠的作用如何，尚未明確。

本研究圍繞上述問題，首先開展了地西泮誘導小鼠睡眠的最小有效劑量的研究，劑量選擇的依據(jù)是參照地西泮治療失眠的人用推薦劑量，根據(jù)體表面積進行折算[27]，求得小鼠的使用劑量為每日1.3～6.5 mg·kg－1，在預實驗中，地西泮在2.5 mg·kg－1時，小鼠未出現(xiàn)翻正反射消失的現(xiàn)象，因此在該實驗中設置5.2 mg·kg－1為初始濃度，結果表明，當?shù)匚縻褂脛┝窟_到20.8 mg·kg－1時，與空白組小鼠相比，地西泮組小鼠睡眠時間顯著延長，且入睡率達到100%，因此后續(xù)實驗均在該劑量下進行。

在課題組前期的炒酸棗仁改善小鼠睡眠作用的量效關系實驗中發(fā)現(xiàn)，炒酸棗仁在20～80 g·kg－1的劑量范圍內，其改善睡眠的作用呈現(xiàn)劑量依賴關系，當劑量達到80 g·kg－1時，其改善睡眠的作用最佳[4]，故在本研究中，采用其改善睡眠作用的最佳劑量作為給藥劑量，探討其對地西泮所致的睡眠及宿醉效應的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，炒酸棗仁可以延長地西泮所致小鼠睡眠持續(xù)時間，但是對地西泮所致睡眠的入睡潛伏期無影響，說明炒酸棗仁對地西泮所致的睡眠具有協(xié)同增效的作用。在炒酸棗仁對地西泮所致宿醉效應的影響實驗中，發(fā)現(xiàn)炒酸棗仁可使給予地西泮的小鼠自主活動次數(shù)和站立次數(shù)增多，而在高架十字迷宮實驗，因為地西泮和炒酸棗仁均具有抗焦慮[28-30]的作用，因此單獨給予地西泮以及炒酸棗仁聯(lián)合地西泮應用均表現(xiàn)出一定的抗焦慮的作用，炒酸棗仁聯(lián)合地西泮組小鼠的開放臂進入次數(shù)以及閉臂進入次數(shù)增多，反映了炒酸棗仁可使給予地西泮的小鼠自主活動能力增強。

本研究結果顯示炒酸棗仁與地西泮聯(lián)合使用可以減輕地西泮的宿醉效應，主要表現(xiàn)為增強小鼠的自主活動能力，減輕對小鼠清醒后的持續(xù)抑制狀態(tài)。綜上所述，炒酸棗仁對地西泮具有一定的“增效減毒”的作用，該作用可能與影響地西泮的體內代謝過程有關，其詳細作用機制還需要進一步研究。