骨形態(tài)發(fā)生蛋白9的研究進(jìn)展

摘要：骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（BMP-9）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族的成員之一，已知BMP家族中成骨活性最強(qiáng)的成員；Smad蛋白在其信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用；BMP-9腺病毒為載體表現(xiàn)出強(qiáng)大成骨能力；BMP-9還具有促進(jìn)原始神經(jīng)元乙酰膽堿的合成，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞，降低血糖等作用。

關(guān)鍵詞：骨形態(tài)發(fā)生蛋白9；信號(hào)通路；成骨作用；腺病毒

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，簡(jiǎn)稱BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成員之一，在人體內(nèi)由肝臟合成并分泌，具有多種生物學(xué)功能，尤其是骨誘導(dǎo)能力，現(xiàn)已成為了醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，特別是為難以突破的骨缺損修復(fù)問(wèn)題提供了新的治療方法，現(xiàn)階段BMP家族中的BMP-2和BMP-7以被成功應(yīng)用到臨床治療中，并取得了良好的效果。BMP-9又稱GDF2（growth differentiation factor 2），是已知BMP家族中成骨活性最強(qiáng)的成員，因其骨誘導(dǎo)活性不會(huì)受到免疫反應(yīng)的較大抑制，故也是該家族中唯一能在有免疫能力的活體動(dòng)物體內(nèi)顯著誘導(dǎo)骨形成的成員。目前研究已證實(shí)，動(dòng)物模型中BMP-9可有效地修復(fù)骨缺損。現(xiàn)階段BMP-9 的成骨機(jī)制、成骨作用、表達(dá)純化方法、載體及支架材料的選擇已經(jīng)成為目前研究工作的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

1基本特征

BMP9（也稱GDF-2，growth differentiation factor 2）是BMPs 中的一種，主要由肝臟分泌并完成表達(dá)，其免疫原性較低，通常不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，只具有輕微的免疫刺激能力。BMP9從結(jié)構(gòu)上看為高度保守的糖蛋白，對(duì)核酸酶以及膠原酶等大部分蛋白酶不敏感，只對(duì)胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)BMP9具有誘導(dǎo)和維持胚胎神經(jīng)元的類膽堿分化、調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝、調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的動(dòng)態(tài)平衡等多種重要功能，BMP-9通常會(huì)以前體和二聚體的形式存在，其在結(jié)構(gòu)上不含有第7保守半胱氨酸這一特點(diǎn)與絕大多數(shù)TGF-β超家族成員相區(qū)別[1-2]。人BMP-9的基因位于染色體10q1 1.22，它的前體蛋白包含428個(gè)氨基酸殘基，該氨基酸序列中有50%-55%與BMP-2，4，5，6，7，8相同，人與鼠的BMP-9有80%的同源性[3-4]。

2信號(hào)傳導(dǎo)通路

2.1 Smad蛋白 現(xiàn)有的研究已經(jīng)確認(rèn)Smad蛋白在TGF-β超家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的作用。TGF-β超家族的二聚配體與細(xì)胞膜表面的Ⅱ和Ⅰ型絲氨酸 /蘇氨酸激酶受體結(jié)合形成異四聚復(fù)合體?；罨蟮蘑裥褪荏w使R-Smad磷酸化 ，磷酸化的R -Smad與Co-Smad形成異聚復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核與其它轉(zhuǎn)錄協(xié)同子和抑制子共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。到目前為止，已經(jīng)從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離和鑒定出8種Smad蛋白，按功能分為3類：即受體活化型（或稱通路限制型）、共同通路型和抑制型。其中、受體活化型具有介導(dǎo)BMPs通路的作用；共同通路型通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)的特異蛋白一起結(jié)合到細(xì)胞的DNA上調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄；抑制型通過(guò)與Ⅰ型受體結(jié)合而抑制BMPs配體的活性[5-7]。

2.2依賴 Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路與非依賴Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路 在BMPs信號(hào)傳導(dǎo)通路的過(guò)程中，異源二聚體受體與BMPs配體結(jié)合后，Ⅱ型受體的轉(zhuǎn)磷酸作用使Ⅰ型受體在絲氨酸/甘氨酸區(qū)被磷酸化，從而激活Ⅰ型受體，Smad 1、Smad 5、Smad 8 羧基端上的絲氨酸序列會(huì)在其絲氨酸激酶的作用下磷酸化從而將信號(hào)傳入至細(xì)胞內(nèi)。接下來(lái)兩個(gè)或者兩個(gè)受體調(diào)控的Smad蛋白分子與一個(gè)Smad 4會(huì)形成一個(gè)異源性三聚體或著形成一個(gè)異源二聚體進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，核轉(zhuǎn)錄因子與核內(nèi)Smads蛋白的MH2區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，作用于目的基因[8-9]。

MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路是目前研究最多的非依賴Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路。MAPK是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，主要有細(xì)胞外相關(guān)信號(hào)蛋白激酶（ERK），兩個(gè)應(yīng)激活性蛋白激酶（JNK），以及p38 MAPK三種類型[10]。它參與細(xì)胞的增殖分化、不同種細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞的惡變。Gresser WA等人的研究表明以上三種蛋白激酶都能提高成骨分化能力[11]。

2.3 BMP-9成骨信號(hào)傳導(dǎo)通路 現(xiàn)有研究表明經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路、Hey1、堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白和過(guò)氧化物酶增殖體活化受體2、激活素受體樣激酶1 和2、胰島素生長(zhǎng)因子2 及類維生素A 等都與BMP-9的骨誘導(dǎo)過(guò)程有關(guān)。BMP-9在結(jié)構(gòu)上有別于TGF-β超家族的其他成員，其型號(hào)傳導(dǎo)通路也有所不同。KangQ等人研究表明，具有成骨作用的BMP-2/6/7，在受到骨形成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子的BMP-3的作用時(shí)，骨形成能力受到較大的抑制，然而對(duì)BMP-9卻不能發(fā)揮作用[12]。HepG2肝腫瘤細(xì)胞能大量表達(dá)BMP-9的兩種高親和性受體（約為54 kD和80 kD），但這兩種受體卻不能與BMP 3，5，6結(jié)合，而僅與BMP-2，4 在有限的程度內(nèi)結(jié)合[13]。這些研究都表明BMP-9存在與TGF-β超家族的其他成員不同的受體，也有可能存在新的信號(hào)傳導(dǎo)通路。此外胰島素生長(zhǎng)因子2，類維生素A也與BMP-9發(fā)揮作用密切相關(guān)。

3 BMP-9與骨形成

3.1 BMP-9與腺病毒 BMP-9的成骨作用須與良好的載體結(jié)合，在生物體內(nèi)發(fā)揮作用。以腺病毒為載體的BMP-9表現(xiàn)出了強(qiáng)大的正位和異位骨誘導(dǎo)活性。在BMPs誘導(dǎo)脊柱融合的實(shí)驗(yàn)中，將Ad-BMP-9和Ad-BMP-2經(jīng)脊柱旁肌肉組織直接注射后證實(shí)有明顯的骨質(zhì)沉積作用，使脊柱融合。Ad-BMP-9誘導(dǎo)椎旁肌肉組織骨發(fā)生的作用比Ad-BMP-2更強(qiáng)[14]。Cheng等的研究發(fā)現(xiàn)以腺病毒為載體的14種人BMP（BMP2-15），作用于成骨細(xì)胞祖細(xì)胞C3H10T1/2和C2C12后，BMP9、2、6三組骨鈣素的表達(dá)明顯，細(xì)胞內(nèi)礦化結(jié)節(jié)的形成最為顯著，此外在成骨細(xì)胞系的培養(yǎng)過(guò)程中加入BMP9、2、6重組腺病毒后，堿性磷酸酶（ALP）顯著表達(dá)，這表明BMP-9以及BMP2，6 具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力[15]。Li 等將5種重組人BMP（rhBMP）腺病毒轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞，植入無(wú)胸腺裸鼠和SD大鼠體內(nèi)，在相同劑量下測(cè)得Ad-BMP-9組ALP活性最高。裸鼠中新骨形成平均體積Ad-BMP-9僅次于Ad-BMP-6，4，而SD大鼠內(nèi)Ad-BMP-9在較BMP-6低100倍的劑量下就能誘導(dǎo)更多的骨，其他則無(wú)骨形成16。這表明Ad-BMP-9在SD大鼠中的成骨活性最強(qiáng)，同時(shí)也提示BMP-9信號(hào)途徑可能不受宿主免疫反應(yīng)的明顯限制。Abdelaal 等將BMP-9以腺病毒為載體注人裸鼠背闊肌中，連續(xù)3 w每周行肌肉組織活檢，第3 w后出現(xiàn)X型膠原、骨橋素（OPN）等軟骨和骨標(biāo)志物，明顯觸摸到肌肉內(nèi)骨組織[17]。

3.2 BMP-9與其他載體 甘強(qiáng)等人以真核質(zhì)粒為載體成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/His Max-BMP-9，但真核表達(dá)系統(tǒng)純化出的 rhBMP-9 的骨誘導(dǎo)活性不及rhBMP-218。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下不僅可分化為成骨細(xì)胞，還μ具有分化為肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。江等人研究表明BMP-9基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs成骨能力較單純MSCs明顯增強(qiáng)[19]。Bessa等從細(xì)菌克隆中得到人BMP-9cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)PCR 擴(kuò)增、質(zhì)粒重組、轉(zhuǎn)染得到表達(dá)BMP-9蛋白的大腸桿菌。LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的大腸桿菌、離心、收集上清液（包含溶解的重組人BMP-9），運(yùn)用帶His 標(biāo)簽的層析柱和脫鹽柱過(guò)濾上清液，得到純化率95%的BMP-9，并證明了其具有較高生物活性[20]。此外、天然生物材料包括膠原（collagen）、脫鈣骨基質(zhì)（demi-neralized bone matrix，DBM）、藻酸鹽（alginate）、透明質(zhì)酸、殼聚糖等； 人工合成高分子材料聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）也都納入了研究范圍。

4 BMP-9的其他生物學(xué)作用

在神經(jīng)系統(tǒng)中BMP-9促進(jìn)胚胎鼠原始神經(jīng)元的乙酰膽堿（ACh）的合成，可誘導(dǎo)膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿小泡轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。BMP-9 與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ bFGF） 在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起協(xié)同作用，BMP-9保持種族特異性，而bFGF保持原始細(xì)胞特性的一致性[21]。

BMP-9 在調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)中有雙向作用，高濃度的BMP9對(duì)造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，低濃度的BMP9則產(chǎn)生促進(jìn)作用。Lopez-CoviellaI的研究報(bào)告表明，用無(wú)血清培養(yǎng)基時(shí)，BMP9的濃度達(dá)到100 μg/ml可以完全抑制體外克隆的造血祖細(xì)胞集落形成單位（CFU-C）增長(zhǎng)的效應(yīng)，反之，當(dāng)BMP-9的濃度為3 μg/ml是可產(chǎn)生促進(jìn)增長(zhǎng)效應(yīng)[22]。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，為糖尿病大鼠單一注射BMP-9 就可使血糖降低并接近正常水平。對(duì)大鼠監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)BMP-9可能通過(guò)促進(jìn)胰腺β細(xì)胞釋放胰島素、調(diào)節(jié)肌肉中的糖原合成激酶及抑制肝糖產(chǎn)生降低血糖[23]。BMP-9 能提高脂代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)，促進(jìn)蘋果酸酶和脂肪酸合酶的合成，在調(diào)節(jié)肝脂肪酸合成過(guò)程中有重要作用[24]。

5展望

BMP-9骨誘導(dǎo)作用的研究已取得一定進(jìn)展，在動(dòng)物模型中已成功地進(jìn)行骨缺損修復(fù)和脊柱融合的基因治療。現(xiàn)有的研究也已證明其是BMPs家族中成骨能力最強(qiáng)的成員，但BMP-9的基本結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)骨形成的機(jī)制以及載體的選擇等問(wèn)題尚不完全明確，隨著研究的深人，BMP9必將有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Groeneveld EH， Burger EH. Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration [J]. Eur J Endocrinol， 2000，12（1）：9-21.

[2]SieberC ，S chwaerzer GK ，K naus P. BoneMorphogenetic Proteins：From Local to Systemic Therapeutics；article[J].BMP signaling is fine tuned on multiple levels.VoⅪ.hardcover ed：Birkha user，2008.

[3]Little SC ，Mullins MC. Bone morphogenetic protein heterodimers assemble heteromeric type I receptor complexes to pattern the dorsoventral axis[J].Nat Cell Biol，2009，11：637-633.

[4]Celeste Al， Song JJ， Cox K， et al[J].J Bone IVfiner Res， 1994，9（Suppl 1）：S13.

[5]Wrana J L. Regulation of Smad activity[J]. cell， 2000，100（2）： 189-192.

[6]Zhang F，QiuT Wu X ， et a1.Sustained BMP signaling in osteoblasts stimulates bone formation by promoting angiogenesis and osteoblast differentiation[J].J BoneMiner Res，2009，24：1224-1233.

[7]Inoue Y Imamura T. Fteguiation of TGF-beta family signaling by E3 ubiquitin ligases[J]. Cancer Sci，2008，99： 2107-2112.

[8]Massague J， Seoane J， Wotton D. Smad transcription factors[J].Genes Dev，2005，19：278-810.

[9]MoustakasA， Souchelnytskyi S， Heldin GH. Small regulation in TGF-psignaling transduction [J]. J Gell Sci， 2001，114（24）：4359-4369.

[10]Lai GF， Gheng S L. Signal transductions induced by bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta in normal human osteoblastic cells[J].J Biol Chem，2002，277：15514-22.

[11]Grass erW A， Gr1ic I， Borovecki F， et al. BMP-6 exerts its osteoinductive effect through activation ofIF-I and EF pathways[J]. Inter }rthopae， 2007，31（6）：759-765.

[12]Kang Q， Sun MH， Cheng H， et al[J].Gene The，2004； 11（17）：1312-132.

[13]Song JJ， Celeste Al， Kong FM， et al[J].Endocrinology， 1995，136（10）：4293-429.

[14]Alden TD， Beres EJ， Laurent JS， et al[J].J Cranicfac Surg， 2000，11（1）：24-30.

[15]ChengH ，Ji angW ，P hilipsF M，et al [J].J Bone Joint SurgA m，2003，85（8）：1544-1552.

[16]Li JZ， Li H Sasaki T， et al. Gene Tier， 2003，10（20）：1735-174

[17]Abdelaal MM， Tbolpady SS， Kessler JD， et al[J].J Craniofac Surg，2004，15（5）：736-744.

[18]甘強(qiáng)，胡偵明.真核表達(dá)重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白9的純化及生物骨誘導(dǎo)活性分析[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2013，30（4）：822-827.

[19]江標(biāo)，李明.人骨形成蛋白9基因修飾的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異位成骨實(shí)驗(yàn)研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，39（5）：723-727.

[20]Bessa PC， Cerqueira MT， Rada T， et al. Expression， purificationand osteogenic bioactivity of recombinant human BMP-4， -9， -10，-11 and -14[J].Protein Expr Purif，2009，63（2）：89-94.

[21]Miller AF，Harvey SA，Thies RS，et al. Bone morphogeneticprotein-9. An autocrine / paracine cytokine in the liver[J].J Biol Chem，2000，275（24）：17 937-17945.

[22]Lopez-Coviella I，Berse B，Thies RS，et al. Upregulationof acetylcholine synthesis by bone morphogenetic protein 9in a murine septal cell line[J].J Physiol Paris，2002，96（1-2）：53-59.

[23]Lopez-Coviella I，Berse B，Krauss R，et al. Induction andmaintenance of the neuronal cholinergic phenotype in thecentral nervous system by BMP-9[J].Science，2000，289（5477）：313-316.

[24]Ploemacher RE，Engels LJ，Mayer AE，et al. Bone morphogeneticprotein 9 is a potent synergistic factor for murinehemopoietic progenitor cell generation and colony formationin serum-free cultures[J].Leukemia，1999，13（3）：428.

編輯/肖慧