茯苓多糖的提取、結(jié)構(gòu)、活性和作用機理研究進展

劉星汶，徐曉飛，劉瑋，趙云鵬，張尚微，沈藝楠，楊繼國，*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808）

茯苓（Poria cocos）為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，是我國重要的傳統(tǒng)藥物之一[1]。作為一種藥食同源的物質(zhì)，我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為茯苓有利水滲濕、健脾和寧心的功效，可以用來治療水腫、小便不利等。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓中多糖成分約占菌核干重的70%～90%[2]，其余為三萜類化合物、甾體類、蛋白質(zhì)等成分[3]。自20世紀(jì)70年代報道茯苓多糖抗腫瘤作用以來[4]，茯苓多糖的功效報道集中于免疫活性調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等作用[5]。茯苓中的多糖不易溶于水，經(jīng)過結(jié)構(gòu)改性后得到溶于水的茯苓多糖，抗腫瘤活性得以提高[6-7]。因此，研究如何高效提取茯苓多糖及后續(xù)的活性、結(jié)構(gòu)研究成為研究的熱點。本文綜述了茯苓多糖的提取、結(jié)構(gòu)研究、功能活性機制及安全性的研究進展。

1 茯苓多糖的制備及結(jié)構(gòu)研究

1.1 茯苓多糖及多糖衍生物的制備方法

茯苓多糖的制備方法包括溶劑法、酶解法和物理輔助法等見表1。茯苓多糖不易溶于水，衍生化后不僅提高茯苓多糖的溶解度，還增強生物活性[8]。茯苓多糖的純化方法與其它多糖基本一致，主要包括蛋白質(zhì)的脫除、茯苓多糖的脫色和酸性與中性茯苓多糖的分離等，采用的純化技術(shù)分別為Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸沉淀法、雙氧水氧化法和離子交換法、二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素柱層析等[9]。

表1 茯苓多糖的提取方法Table 1 Extraction method of Poria cocos-derived polysaccharides

1.2 茯苓多糖的結(jié)構(gòu)研究

來自茯苓菌核和菌絲體的茯苓多糖大多是以β-（1→3）-糖苷鍵為主鏈，伴有少量 β-（1→6）-糖苷鍵的分支葡聚糖[22]。然而，也有新型結(jié)構(gòu)茯苓多糖發(fā)現(xiàn)的報道，如黃燦等[23]采用水提醇沉法提取得到的抗腫瘤活性茯苓多糖，是以（1→6）-糖苷鍵為主鏈，（1→4）-糖苷鍵為支鏈的α-型和β-型吡喃糖，其中吡喃糖包括甘露糖、葡萄糖、果糖、巖藻糖和半乳糖。茯苓多糖的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)稱為茯苓多糖的高級結(jié)構(gòu)。茯苓多糖中以β-（1→3）-葡聚糖為主鏈的高級結(jié)構(gòu)在中性溶液中一般為三股螺旋構(gòu)象[24]。目前，對于茯苓多糖的高級結(jié)構(gòu)的研究較為困難，常用的方法有：剛果紅法、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、圓二光色譜等，但對高級結(jié)構(gòu)的表征都比較粗糙。

2 茯苓多糖的功能活性研究

2.1 免疫調(diào)節(jié)

近幾年，茯苓多糖的免疫調(diào)節(jié)活性主要是研究茯苓多糖通過某些信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)機體免疫功能[25-26]（如圖1）。茯苓多糖不僅能提高機體的非特異性免疫功能，還能提高特異性免疫，包括體液免疫和細胞免疫，有利于血清免疫球蛋白A（immunoglobulin A，I－gA）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）的合成[27]。茯苓多糖通過促進巨噬細胞、B細胞和T細胞等免疫細胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子，進而刺激NK細胞、輔助性T細胞和殺傷T細胞等參與免疫調(diào)節(jié)[28-31]。此外，茯苓多糖還可以促使巨噬細胞上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的表達[32]。目前發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖在巨噬細胞中的信號傳導(dǎo)有兩條途徑（圖 2）：1）Ca2+/蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）/p38蛋白激酶/核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路可能參與茯苓多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[25]；2）茯苓多糖激活Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR 4）信號通路，增加髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）的表達，從而增強下游TRAF 6/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性[26]。

圖1 茯苓多糖對免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用Fig.1 Regulation effect of Poria cocos-derived polysaccharides on immune system

圖2 茯苓多糖在巨噬細胞中的信號傳導(dǎo)途徑Fig.2 Signal transduction of Poria cocos-derived polysaccharides in macrophages

2.2 抗腫瘤作用

Liu X等[33]研究純化后的羧甲基茯苓多糖對人結(jié)腸癌細胞（HT-29）、人肝癌細胞（HepG-2）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、人胃癌細胞（SGC-7901）和人肺癌細胞（A549）的體外抗腫瘤活性，結(jié)果表明純化得到的羧甲基茯苓多糖具有良好的抗腫瘤作用和抗炎作用。在小鼠實驗中，羧甲基茯苓多糖（carboxymethyl pachymaran，CMP） 能有效地增強 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）對CT26荷瘤小鼠的療效，同時減輕5-Fu所致的小鼠肝損傷，并認為羧甲基茯苓多糖的調(diào)控機制可能與NF-κB、NF-E2-相關(guān)核因子2-抗氧化反應(yīng)元件（Nrf2-ARE）及絲裂原活化蛋白激酶/P38蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶通路有關(guān)[34]。茯苓多糖促使宿主的噬菌體、T細胞、B細胞和NK細胞通過釋放細胞因子增強免疫系統(tǒng)活性、上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達，進而使腫瘤細胞凋亡[35-37]（如圖3）。其中，茯苓多糖既可以由Fas配體介導(dǎo)細胞凋亡，也可以由內(nèi)源線粒體途徑引發(fā)細胞的凋亡[38]。

圖3 茯苓多糖的抗腫瘤機制猜想Fig.3 Conjecture on the anti-tumor mechanism of Poria cocos-derived polysaccharides

2.3 抗氧化作用

茯苓多糖能升高機體組織中的超氧化物歧化酶活力并降低丙二醛含量，從而增強機體組織的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，其中胞內(nèi)多糖的抗氧化活性優(yōu)于胞外多糖和菌核多糖[39-40]。通過采用凝膠滲透色譜-示差檢測-多角度激光光散射聯(lián)用法檢測羧甲基茯苓多糖的結(jié)構(gòu)，并分析羧甲基茯苓多糖抗氧化活性的“構(gòu)-效”關(guān)系，得出類球形羧甲基茯苓多糖的抗氧化活性較強，無規(guī)卷曲的活性最弱[41]。利用過氧化氫降解制備不同分子量的CMP研究其抗氧化與分子量之間的關(guān)系，表明隨著分子量的降低CMP的抗氧化活性提高[42]。動物水平的研究發(fā)現(xiàn)硫酸化茯苓多糖（sulfation pachymaranon，SP） 對 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有神經(jīng)保護作用，其潛在機制可能是提高腦組織抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[43]。

2.4 抗炎

茯苓多糖在肝炎和腸炎模型中均有抗炎作用。對茯苓多糖的抗炎機理進行研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖對醋氨酚誘導(dǎo)的小鼠肝損傷之所以具有藥理活性，可能是因為抑制了肝細胞中NF-κB途徑的細胞凋亡和炎性應(yīng)激[44]。采用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)評估羧甲基茯苓多糖對三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型的干預(yù)作用，表明羧甲基茯苓多糖通過降低結(jié)腸炎小鼠血清中的促炎細胞因子水平，提高抗炎細胞因子水平對腸炎小鼠起到保護作用。一方面是通過脂肪酸代謝、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信號通路等發(fā)揮抗炎作用；另一方面可通過油酸和二氫睪丸激素途徑進行抗炎，進而降低腸炎的嚴(yán)重性[45]。石振國等[46]采用不同劑量的茯苓多糖灌胃大鼠，對大鼠腸道分別用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（reverse transcription-polymerase chain reac－tion，RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茯苓多糖可減輕急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能損傷和炎性反應(yīng)，可能是由于抑制了JANUS激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3通路，進而減少細胞因子的產(chǎn)生。在機體受到病原體入侵時，茯苓多糖能促進免疫因子分泌從而提高機體免疫系統(tǒng)的功能。但過度的免疫反應(yīng)卻會對機體自身造成傷害，炎癥反應(yīng)就是劇烈的免疫反應(yīng)的結(jié)果之一。此時，茯苓多糖可能通過抑制白介素-6、腫瘤壞死因子-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA的表達和抑制絲裂素活化蛋白激酶信號通路相關(guān)的磷酸化應(yīng)激激活蛋白激酶和磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的表達進而達到抗炎效果[47]。

2.5 抗病毒

茯苓多糖的抗病毒活性主要集中于細胞層面的研究。王楠[48]研究證明羧甲基茯苓多糖鈉對病毒所致的細胞病變具有抑制作用。采用細胞病變抑制試驗方法分析了羧甲基茯苓多糖鈉體外抗單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus－Ⅰ，HSV－Ⅰ）所具有的作用，證明羧甲基茯苓多糖鈉量為2.0 mg/mL時，對HSV－Ⅰ所致豬腎傳帶細胞中的細胞病變有明顯的抑制作用。以阿昔洛韋作為陽性對照，觀察CMP的人肝癌HepG2.2.15細胞毒作用，并觀察羧甲基茯苓多糖對肝纖維化小鼠細胞因子的影響，蛋白質(zhì)印跡法檢測Smad3和Smad7的表達結(jié)果顯示，羧甲基茯苓多糖具有抑制乙型肝炎病毒，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等作用[49]。

2.6 抗菌

茯苓多糖還具有抗菌作用。茯苓多糖對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑菌性[50]。別蒙等[51]研究不同取代度（0.350～0.728）的羧甲基茯苓多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)表征及體外抑菌活性，認為羧甲基茯苓多糖取代度越高，其抑菌效果越好，且對革蘭氏陽性菌的抑菌效果比陰性的要高。原因可能是羧甲基茯苓多糖的取代度越高，其水溶性及電位絕對值越高，進而破壞了細菌的細胞膜，抑制細菌的生長繁殖。此外，茯苓多糖與蓮花種子中的低聚原花青素具有協(xié)同抗菌作用，一方面由于茯苓多糖和原花青素間的氫鍵、疏水性和靜電相互作用使得二者混合物的電位發(fā)生變化，影響細菌細胞壁的電荷分布從而降低細胞壁的穩(wěn)定性；另一方面茯苓多糖和原花青素的混合增加了氧化應(yīng)激反應(yīng)對細胞膜造成的損害[52-53]。

3 茯苓多糖的安全性研究

林麗霞等[54]在 3 個不同劑量組（400、200、100mg/kg）下研究灌胃茯苓多糖對小鼠一般行為、自發(fā)活動、睡眠時間、轉(zhuǎn)棒運動及急性毒性反應(yīng)的影響；在3個不同劑量組（352、176、88 mg/kg，十二指腸給藥）下研究茯苓多糖對犬的影響，發(fā)現(xiàn)茯苓多糖對小鼠和犬均無明顯影響。體內(nèi)研究證實，SP灌胃小鼠給藥的半數(shù)致死量為7.358 g/kg，屬低毒性物質(zhì)[55]。鄭麗紅等[56]按0.750、1.50、3.00 g/kg劑量的茯苓多糖均勻拌入飼料中連續(xù)喂養(yǎng)80只隨機分組的遠交群大鼠，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取的茯苓多糖對大鼠無毒副作用。羧甲基茯苓多糖靜脈注射小鼠的半數(shù)致死量為（3.13±0.14）g/kg，羧甲基茯苓多糖313 mg/（kg·d）靜脈注射3個月，對犬沒有呈現(xiàn)毒副作用；羧甲基茯苓多糖250 mg/kg腹腔注射小鼠沒有出現(xiàn)突變、大鼠沒有出現(xiàn)畸胎[57]。由此表明，茯苓多糖和羧甲基茯苓多糖毒副作用小。

4 展望

目前，茯苓多糖的提取分離和純化技術(shù)較為成熟。但一些方面的研究還是相對比較薄弱，如由于缺乏測定茯苓多糖完整的高級結(jié)構(gòu)的方法，目前主要是采用間接法進行測量，如剛果紅法；還可以深入研究其它直觀檢測方法，如掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡等。對茯苓多糖的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎作用雖有較多的報道，但與茯苓多糖分子量、取代度、取代基團的構(gòu)效關(guān)系研究尚淺。多糖結(jié)構(gòu)與活性研究是學(xué)術(shù)界研究熱點。然而，以β-（1→3）-D-葡萄糖為主鏈特征的一大類β-葡聚糖，其口服作用機制報道卻很少，僅有的少量研究表明β-葡聚糖口服難以吸收。用熒光標(biāo)記3種可溶性β-葡聚糖（laminarin、scleroglucan和glucan phosphate）對大鼠進行口服給藥，盡管在血液中檢測到了多糖被吸收，最終發(fā)現(xiàn)3種β-葡聚糖中最高的生物利用度僅為4.9%[58]；而人體口服400 mg β-葡聚糖（重均分子量為20 kDa）能增加唾液免疫球蛋白A水平，但在血液里檢測不出β-葡聚糖[59]。至今為止，β-葡聚糖口服作用機制仍不清楚，使其功效作用常受到質(zhì)疑、應(yīng)用受阻，因此亟需開展β-葡聚糖的口服作用機制研究。茯苓多糖是一種典型的β-葡聚糖，在茯苓菌核中含量高，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的經(jīng)濟適宜性，可用于功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用。隨著對茯苓多糖的研究更加深入，相信茯苓多糖未來在產(chǎn)業(yè)化中將會擁有廣闊的前景。