蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理及其與阿卡波糖的協(xié)同作用

秦朝鳳，李 姣，郝經(jīng)文，卜雅琴，李 勝，陳乃東,3,*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；3.中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與品質(zhì)提升安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012）

糖尿病屬于慢性代謝性疾病，需要通過(guò)藥物治療才能有效地控制血糖[1]。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，成年糖尿病人數(shù)從2000年的1.51億增長(zhǎng)至2017年的4.25億，預(yù)計(jì)2045年將達(dá)6.29億[2]。其中，2型糖尿病被認(rèn)為是糖尿病的主要類型，它是由于胰島素分泌不足而導(dǎo)致的餐后高血糖[3]。此外，有研究表明，持續(xù)的餐后高血糖往往會(huì)引起多種并發(fā)癥，尤其是心腦血管疾病的發(fā)生[4]。因此，控制餐后高血糖已成為治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要手段。淀粉作為最重要的碳水化合物來(lái)源之一，在人類飲食中貢獻(xiàn)了約40%～60%的能量。然而，體內(nèi)對(duì)淀粉的快速消化會(huì)導(dǎo)致餐后血糖的快速增加，這與代謝性疾病2型糖尿病呈正相關(guān)[5-6]。因此，減少淀粉的消化速度吸引了越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。其中，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以通過(guò)抑制小腸中的糖苷酶活性，延緩對(duì)所攝入的碳水化合物的消化，進(jìn)而降低對(duì)葡萄糖的吸收，從而達(dá)到對(duì)血糖水平的控制[7]。

蘆薈大黃素即1,8-二羥基-3-羥甲基-9,10蒽醌，是多種中草藥的天然生物活性蒽醌類化合物，主要來(lái)源于百合科蘆薈葉片、蓼科大黃根莖、巴天酸模、山扁豆等植物[8]。蘆薈大黃素被用作中藥已有2 000多年的歷史，來(lái)源廣泛，具有安全、經(jīng)濟(jì)、高效的優(yōu)點(diǎn)，目前仍存在于各種中藥制劑[9]。蘆薈大黃素已被證實(shí)具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、抗寄生蟲(chóng)、神經(jīng)保護(hù)和肝保護(hù)等，因此，它已被廣泛用于治療流感病毒、炎癥、敗血癥、阿爾茨海默病、青光眼、瘧疾、肝纖維化、銀屑病、2型糖尿病、生長(zhǎng)障礙和幾種癌癥等[10]。對(duì)于糖尿病方面，有研究表明，蘆薈大黃素能夠在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和不抵抗情況下激活糖原合成通路；從而降低培養(yǎng)基中葡萄糖水平，增加糖原合成，實(shí)現(xiàn)降低血糖的目的[11]。此外，Lu Ling等[12]研究得出蘆薈大黃素可能通過(guò)抑制干擾素調(diào)節(jié)因子4、Notch1、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路，降低腎組織膠原活性，從而減緩糖尿病腎病癥狀，減輕對(duì)腎組織的損害。

蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性是否有抑制作用以及如何發(fā)揮抑制作用目前均尚未明確，并缺乏對(duì)其聯(lián)合抑制作用的探討。鑒于此，本研究擬系統(tǒng)探究蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果和抑制機(jī)制。主要采用酶抑制動(dòng)力學(xué)、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）、熒光猝滅等多種手段，從體外分子水平探究蘆薈大黃素抑制α-葡萄糖苷酶的作用機(jī)理，并探究蘆薈大黃素與阿卡波糖的聯(lián)合抑制作用效果，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用蘆薈大黃素作為調(diào)節(jié)人體血糖的保健食品配方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆薈大黃素（≥98%）購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司，來(lái)源于蘆薈葉片，土黃色結(jié)晶粉末。其水溶性較低，本研究用含二甲基亞楓的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解（反應(yīng)液中二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)5%），無(wú)異常氣味。

α-葡萄糖苷酶（酶活力≥71.2 U/mg）、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）（≥99%）、阿卡波糖（≥95%）合肥博美生物科技有限公司；對(duì)硝基苯酚（≥99%）、二甲基亞楓（≥99.9%）、磷酸氫二鉀（≥99%）、磷酸二氫鉀（≥99%）、溴化鉀（≥99.95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純；溶液均采用雙蒸水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；TU-1950型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4600型熒光分光光度計(jì) 日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；Thermo Scientific Nicolet iS10型FTIR儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13-14]方法并稍作改動(dòng)。具體操作步驟為：α-葡萄糖苷酶和PNPG溶解在PBS（0.1 mol/L、pH 6.8）中。將80 μL不同質(zhì)量濃度（25、50、100、150、200 μg/mL）的蘆薈大黃素溶液和20 μLα-葡萄糖苷酶溶液（28 μg/mL）混合，在37 ℃條件下預(yù)孵育10 min平衡反應(yīng)后，將8 mmol/L的PNPG溶液（40 μL）作為底物加入預(yù)孵育混合液體系中引發(fā)反應(yīng)。37 ℃條件下反應(yīng)30 min后，立刻加入1 mol/L碳酸鈉溶液60 μL以停止反應(yīng)。最后使用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度。將阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率：

式中：A樣品、A樣品空白、A對(duì)照及A對(duì)照空白分別表示添加蘆薈大黃素和酶反應(yīng)的吸光度、添加蘆薈大黃素反應(yīng)的吸光度、添加酶反應(yīng)的吸光度及蘆薈大黃素和酶均未添加反應(yīng)的吸光度。

1.3.2 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)所述方法，當(dāng)α-葡萄糖苷酶質(zhì)量濃度為28 μg/mL時(shí)，分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0、40、80、120、160 μg/mL）的蘆薈大黃素在底物PNPG濃度分別為0.5、1、2、4、6、8 mmol/L時(shí)酶的反應(yīng)初速率。按照式（2）以1/V對(duì)1/[S]作圖，得出Lineweaver-Burk曲線圖，并計(jì)算其抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax），以此判定蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型[15-16]。利用式（3）進(jìn)行二次作圖，得到蘆薈大黃素與酶的解離常數(shù)Ki及蘆薈大黃素與酶-底物結(jié)合的復(fù)合物的解離常數(shù)Ki’，根據(jù)Lineweaver-Burk曲線特征及Ki、Ki’大小判斷其具體抑制類型，分析其抑制作用機(jī)制。

式中：[S] 和[I] 分別表示底物和抑制劑的濃度/（mmol/ L）；V表示初始反應(yīng)速率/（mmol/（L·min））；Km和Vmax分別表示米氏常數(shù)/（mmol/L）和最大反應(yīng)速率/（mmol/（L·min））；Ki和Ki’均為解離常數(shù)/（μg/mL）。

1.3.3 紫外分析

參照文獻(xiàn)[17-18]方法并稍作修改，將300 μL不同質(zhì)量濃度（0、20、40、60、80、100、120、140 μg/mL）的蘆薈大黃素加入到3 mLα-葡萄糖苷酶溶液（112 μg/mL）中，置于37 ℃條件下反應(yīng)10 min后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描240～310 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。以未添加蘆薈大黃素的α-葡萄糖苷酶溶液作為對(duì)照。

1.3.4 FTIR分析

參照文獻(xiàn)[14,18]的方法，并稍作修改，將0.5 mLα-葡萄糖苷酶（1 mg/mL）和1 mL蘆薈大黃素（0.25 mg/mL）的混合溶液在37 ℃條件下孵育10 min。然后將反應(yīng)后的混合溶液冷凍干燥，進(jìn)行FTIR測(cè)定。對(duì)照組采用PBS代替蘆薈大黃素溶液。通過(guò)溴化鉀壓片法，利用FTIR對(duì)樣品進(jìn)行分析。在4 cm-1的分辨率下進(jìn)行60 次掃描，記錄4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的吸光度。

1.3.5 熒光猝滅分析

參考文獻(xiàn)[14,16]的方法，并稍作修改，測(cè)量不同質(zhì)量濃度蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光的猝滅作用。在3 mL 28 μg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液中加入不同質(zhì)量濃度（0、20、40、60、80、100、120、140 μg/mL）的蘆薈大黃素溶液300 μL，分別在297.15、303.15、310.15 K溫度條件下反應(yīng)10 min，用等量PBS作為對(duì)照。在3 種不同溫度下，記錄300～500 nm波長(zhǎng)處的熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射帶寬均設(shè)置為5 nm。在發(fā)射光譜中扣除空白光譜（PBS）。蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅類型由Stern-Volmer方程確定，公式如下：

式中：F0和F分別為無(wú)或有蘆薈大黃素時(shí)α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度；Kq為猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Ksv為猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為蘆薈大黃素的濃度/（mol/L）；τ0為熒光團(tuán)的壽命/s；Ka和n分別為蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

通過(guò)計(jì)算相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)，以確定蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間相互作用的主要結(jié)合力類型[19]。焓變（ΔH0）、熵變（ΔS0）和自由能變化（ΔG0）3 個(gè)熱力學(xué)參數(shù)可由van’t Hoff方程確定，公式如下：

式中：T為溫度/K；R為氣體常數(shù)/（8.314 J/（mol·K））；ΔG0、ΔH0和ΔS0分別為自由能變化/（kJ/mol）、焓變/（kJ/mol）和熵變/（kJ/（mol·K））。

1.3.6 協(xié)同抑制作用分析

參考文獻(xiàn)[20]的方法研究阿卡波糖與蘆薈大黃素聯(lián)合抑制-葡萄糖苷酶活性的作用。Va和Vb分別為阿卡波糖和蘆薈大黃素存在時(shí)，α-葡萄糖苷酶的剩余活性。抑制劑阿卡波糖和蘆薈大黃素同時(shí)存在時(shí)，α-葡萄糖苷酶的剩余活性定義為Vab。Vc表示預(yù)期的α-葡萄糖苷酶的剩余活性。假設(shè)兩種抑制劑的抑制作用是相互獨(dú)立的，則Vc等于VaVb。為了分析阿卡波糖與蘆薈大黃素的相互作用類型，將Vab-Vc值范圍在-0.1以下視為協(xié)同作用，在-0.1和0.1之間的值視為相加作用，超過(guò)0.1的值視為亞相加作用[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的評(píng)價(jià)

如圖1所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蘆薈大黃素和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果均隨著質(zhì)量濃度增加明顯增強(qiáng)。由Origin非線性擬合得到蘆薈大黃素的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為75.97 μg/mL，而阿卡波糖IC50為338.84 μg/mL。以上結(jié)果表明，蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖更強(qiáng)，對(duì)α-葡萄糖苷酶有更好的抑制作用[22]。

圖1 蘆薈大黃素和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of aloe emodin and acarbose on α-glucosidase

2.2 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型的分析

如圖2a所示，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中所有直線交于第3象限。隨著蘆薈大黃素質(zhì)量濃度的增加，橫截距越小、縱截距均越大，即Vmax和Km均呈下降趨勢(shì)，此結(jié)果說(shuō)明蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型是一種非競(jìng)爭(zhēng)與反競(jìng)爭(zhēng)的混合型抑制。

圖2 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot for the inhibitory effect of aloe emodin on α-glucosidase

由圖2b、c可知，抑制劑與α-葡萄糖苷酶作用的解離常數(shù)Ki值為88.78 μg/mL，而抑制劑與α-葡萄糖苷酶-PNPG的復(fù)合物作用的解離常數(shù)Ki’值為25.90 μg/mL，說(shuō)明蘆薈大黃素更傾向于與α-葡萄糖苷酶-底物復(fù)合物結(jié)合。詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。

表1 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for α-glucosidase inhibition by aloe emodin

2.3 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶紫外光譜的影響

紫外-可見(jiàn)吸收光譜法是一種可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)在抑制劑作用下，酶的結(jié)構(gòu)及復(fù)合物形成的一種新方法。α-葡萄糖苷酶在280 nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰，是由于其芳香族氨基酸發(fā)生π→π*躍遷所引起的[23]。由圖3可以看出，α-葡萄糖苷酶的紫外吸收峰在沒(méi)有或存在蘆薈大黃素時(shí)存在顯著差異。隨著蘆薈大黃素質(zhì)量濃度的增加，特征峰的位置并沒(méi)有顯著地移動(dòng)，但α-葡萄糖苷酶的吸收峰強(qiáng)度大幅增加，吸收峰強(qiáng)度變化具有濃度依賴性，這說(shuō)明蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用，形成了新的復(fù)合物。該現(xiàn)象表明α-葡萄糖苷酶-蘆薈大黃素復(fù)合物的形成可能會(huì)有利于分子間和分子內(nèi)聚集，破壞Trp和Tyr芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境空間結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化和疏水基團(tuán)的暴露，這與沈荷玉等[17]研究沒(méi)食子酸與α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶結(jié)合的紫外光譜圖結(jié)果相似。

圖3 蘆薈大黃素質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶紫外光譜的影響Fig.3 Effect of aloe emodin concentration on UV spectra of α-glucosidase

2.4 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶FTIR的影響

紅外光譜分析是研究蘆薈大黃素誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)變化的重要手段。蛋白質(zhì)的FTIR由幾個(gè)特征吸收峰組成，包括N—H拉伸振動(dòng)（3 300～2 070 cm-1）峰，酰胺I 鍵（1 700～1 600 cm-1）、酰胺II 鍵（1 600～1 500 cm-1）和酰胺III鍵（1 400～1 200 cm-1）特征峰[24]。據(jù)報(bào)道，酰胺I鍵（C＝O拉伸振動(dòng)）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化比其他鍵更敏感[25]。因此，為了進(jìn)一步確定化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的影響，使用FTIR儀檢測(cè)樣品的酰胺I鍵特征峰。如圖4所示，在蘆薈大黃素的存在下，α-葡萄糖苷酶的特征峰數(shù)量沒(méi)有增加，說(shuō)明酶與抑制劑相互作用過(guò)程中沒(méi)有形成新的共價(jià)鍵[26]。另一方面，在α-葡萄糖苷酶溶液中加入蘆薈大黃素后，酰胺I鍵的吸收峰強(qiáng)度明顯增加，且酰胺I鍵由1 654.58 cm-1藍(lán)移到1 650.11 cm-1，表明蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶發(fā)生了相互作用并對(duì)其構(gòu)象產(chǎn)生了影響。

圖4 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶紅外光譜的影響Fig.4 Effect of aloe emodin on IR spectra of α-glucosidase

2.5 蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響

熒光光譜法常被用于研究蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用[27]。因?yàn)楹蠺rp、Tyr和Phe等芳香族氨基酸，所以α-葡萄糖苷酶會(huì)產(chǎn)生一種內(nèi)源性熒光，而熒光的強(qiáng)度和位置與這些芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境有著緊密的聯(lián)系[28]。如圖5所示，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射特征峰位于340 nm處，隨著蘆薈大黃素的加入（0～140 μg/mL），該體系的熒光強(qiáng)度降低，但最大發(fā)射波長(zhǎng)并無(wú)明顯變化，這說(shuō)明蘆薈大黃素能夠通過(guò)與酶的相互作用強(qiáng)烈地猝滅α-葡萄糖苷酶的固有熒光，且使其芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生變化。

圖5 蘆薈大黃素質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig.5 Effect of aloe emodin concentration on fluorescence spectra of α-glucosidase

從圖6a可以看出，蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系良好。由表2可知，Ksv值隨著溫度的升高而減小，由2.101×103L/mol降低至1.755×103L/mol；Kq值遠(yuǎn)大于生物大分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/（mol·s），其值均大于1.5×1011L/（mol·s），說(shuō)明蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅不是動(dòng)態(tài)碰撞引起的，而是通過(guò)酶-配體復(fù)合物的形成引起的靜態(tài)猝滅。

表2 蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶相互作用及熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters for the interaction between aloe emodin and α-glucosidase

圖6 蘆薈大黃素猝滅α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of α-glucosidase by aloe emodin

2.6 蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的熱力學(xué)參數(shù)及相互作用力類型的判斷

為了進(jìn)一步確定蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的相互作用機(jī)制，可以通過(guò)式（5）計(jì)算確定結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），結(jié)果如圖6b所示。由表2可知，隨著溫度的升高，結(jié)合常數(shù)Ka也隨之增加，由1.898×102L/mol增加至3.927×105L/mol，說(shuō)明溫度越高，蘆薈大黃素與酶結(jié)合的親和力越強(qiáng)，即蘆薈大黃素與酶形成的復(fù)合物穩(wěn)定性提高；同時(shí)，結(jié)果表明在大部分溫度下蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的相互作用位點(diǎn)趨向于1。

根據(jù)van’t Hoff公式計(jì)算ΔH0、ΔS0及ΔG0的變化，從而確定蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用力。配體與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用力一般有4 種類型，即靜電相互作用、氫鍵、范德華力和疏水相互作用[29]。如表2 所示，ΔG0為負(fù)值，證明了蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的相互作用是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程。而ΔH0為452.03 kJ/mol，ΔS0為1.562 kJ/（mol·K），表明其相互作用力主要是疏水相互作用。

2.7 蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)合抑制α-葡萄糖苷酶的作用分析

許多研究表明，兩種或兩種以上的抑制劑聯(lián)合使用可以協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的活性。本研究采用報(bào)道的方法計(jì)算組合作用的類型，根據(jù)聯(lián)用后α-葡萄糖苷酶的剩余活性Vab與預(yù)期的α-葡萄糖苷酶的剩余活性Vc的差值判斷，差值在-0.1以下為協(xié)同作用，在-0.1和0.1之間的值為相加作用[21]，相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。蘆薈大黃素與阿卡波糖組合的Vab-Vc值范圍均在-0.1以下，表明蘆薈大黃素與阿卡波糖低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度的組合對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性均具有協(xié)同抑制作用，即蘆薈大黃素與阿卡波糖的結(jié)合可以增強(qiáng)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。因此，可以推測(cè)出蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)用時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用優(yōu)于單一抑制劑，能有效地提高抑制能力并降低阿卡波糖的不良反應(yīng)。

表3 阿卡波糖與蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的協(xié)同作用Table 3 Synergistic effect of acarbose combined with aloe emodin on α-glucosidase activity

3 討論

α-葡萄糖苷酶是2型糖尿病的治療靶點(diǎn)，其抑制劑可以通過(guò)阻礙膳食碳水化合物的消化，將餐后血糖維持在正常水平。大量研究表明，自然界中存在的天然產(chǎn)物是α-葡萄糖苷酶抑制劑的重要來(lái)源，包括黃酮類化合物、酚酸、單寧酸、類胡蘿卜素、萜類、糖類和生物堿等[30-31]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效藥物對(duì)調(diào)節(jié)血糖濃度和控制餐后高血糖具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以蒽醌化合物中的蘆薈大黃素為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)于阿卡波糖。另外，研究可知蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型是非競(jìng)爭(zhēng)與反競(jìng)爭(zhēng)的混合型抑制，其抑制類型與阿卡波糖不同。

Zheng Yuxue等[14]通過(guò)紅外光譜、圓二色光譜和熒光光譜研究阿魏酸對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理，證實(shí)了阿魏酸與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，猝滅其固有熒光強(qiáng)度，并證實(shí)隨著阿魏酸的加入，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。沈荷玉等[17]采用紫外光譜和圓二色光譜分析表明，沒(méi)食子酸的加入導(dǎo)致酶構(gòu)象發(fā)生變化，熒光光譜結(jié)果表明沒(méi)食子酸以靜態(tài)猝滅的方式強(qiáng)烈猝滅酶的內(nèi)源性熒光，改變氨基酸殘基Trp和Tyr所處的微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)也采用多種光譜分析方法研究蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理。首先運(yùn)用紫外光譜法初步分析蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，得出蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間形成一種新的復(fù)合物。再運(yùn)用紅外光譜法得出蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用使其構(gòu)象發(fā)生改變。最后利用熒光光譜法深入探究?jī)烧叩淖饔脵C(jī)制，其結(jié)果表明蘆薈大黃素通過(guò)靜態(tài)猝滅的方式猝滅α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光，且結(jié)合方式以疏水作用力為主。

單藥大劑量的使用常常會(huì)產(chǎn)生多種不良反應(yīng)或藥物抗性，而將兩種或兩種以上具有協(xié)同治療作用的藥物組合使用時(shí)，可明顯降低藥物的劑量和毒性。聯(lián)合用藥所產(chǎn)生的協(xié)同效果一般具有以下的優(yōu)勢(shì)：在顯著增加治療效果的同時(shí)，可以減少藥物使用的劑量，即能夠增加或保持相同療效以減緩毒副作用的發(fā)生以及減少或減緩耐藥性的發(fā)生。當(dāng)具有不同機(jī)制或作用模式的藥物直接作用于單一靶點(diǎn)或某一種疾病時(shí)，可以起到更有效的治療效果。阿卡波糖是一種典型的α-葡萄糖苷酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，臨床常用來(lái)治療餐后高血糖[32]。但大量或長(zhǎng)期服用阿卡波糖可引起腹脹、腹瀉等副作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，天然降糖產(chǎn)品與阿卡波糖聯(lián)合使用可以提高阿卡波糖的療效，延長(zhǎng)其降糖活性[33]。因此，針對(duì)糖尿病的治療方案，迫切需要對(duì)傳統(tǒng)藥物和天然產(chǎn)物的聯(lián)合使用進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將蘆薈大黃素與阿卡波糖以不同質(zhì)量濃度聯(lián)合使用，結(jié)果表明蘆薈大黃素與阿卡波糖具有協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的作用，即蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)合使用能更好地改善降糖效果。目前，越來(lái)越多的研究表明兩種不同類型的抑制劑同時(shí)使用時(shí)具有協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的效果。Yang Jichen等[20]曾報(bào)道過(guò)4 種黃酮類化合物（芹菜素、野黃芩素、高車前素和澤蘭黃酮）與阿卡波糖聯(lián)合抑制α-葡萄糖苷酶活性具有協(xié)同作用，其中，芹菜素與阿卡波糖組合的協(xié)同效果最好，低濃度和高濃度均有協(xié)同抑制作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

4 結(jié)論

本研究以蘆薈大黃素作為蒽醌類化合物代表，采用抑制動(dòng)力學(xué)、紫外光譜法、紅外光譜法和熒光光譜法系統(tǒng)研究蘆薈大黃素抑制α-葡萄糖苷酶的機(jī)理，并對(duì)蘆薈大黃素和阿卡波糖聯(lián)用的抑制作用進(jìn)行了研究。蘆薈大黃素IC50為75.97 μg/mL，阿卡波糖IC50為338.84 μg/mL，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖強(qiáng)。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，蘆薈大黃素以非競(jìng)爭(zhēng)性和反競(jìng)爭(zhēng)性混合型抑制類型方式與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，且更傾向于與酶-底物的復(fù)合物結(jié)合。紫外光譜分析結(jié)果表明，蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶之間形成了一種新的復(fù)合物。FTIR分析結(jié)果進(jìn)一步表明，蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶發(fā)生了相互作用并對(duì)其構(gòu)象產(chǎn)生影響。蘆薈大黃素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光光譜分析結(jié)果顯示，蘆薈大黃素通過(guò)靜態(tài)猝滅的方式猝滅α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光，使其所處的環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)而影響其活性。并且，蘆薈大黃素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合主要以疏水相互作用為主。同時(shí)，蘆薈大黃素與阿卡波糖聯(lián)合使用抑制α-葡萄糖苷酶活性的結(jié)果顯示，兩者對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有協(xié)同抑制作用。

綜上所述，蘆薈大黃素能夠很好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而有效地延緩了糖類的消化速度，這對(duì)于改善人體的血糖水平以及控制餐后高血糖都有非常重要的意義。因此，該研究可為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。