微生物法提取馬齒莧和銀杏葉黃酮及其抗氧化活性研究

摘要：采用乙醇和微生物的方法對馬齒莧（Portulaca oleracea L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）葉進行黃酮的提取，并測定粗提液對DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，乙醇提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2.00%和4.37%，微生物提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2.07%和4.84%。馬齒莧和銀杏葉微生物提取液對DPPH自由基的清除作用在相同的稀釋倍數(shù)下高于乙醇提取液，表明微生物提取植物中黃酮具有一定的可行性和優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：馬齒莧（Portulaca oleracea L.）；銀杏（Ginkgo biloba L.）葉；黃酮；微生物；DPPH自由基

中圖分類號：TQ234.2；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.044

Abstract： Ethanol method and microbiological method were used to extract flavonoids from purslane and Ginkgo biloba. DPPH radical scavenging effect of crude extraction was measured. The results showed that the rate of flavonids extracted from Ginkgo and purslane with ethanol method was 2.00% and 4.37%. That from purslane and Ginkgo biloba with microbial method was 2.07% and 4.84%. Scavenging of DPPH radicals of microbial extract at the same dilution factor was higher than that of ethanol extract， indicating that microbiologial method of extracting the flavonoids from plants had certain feasibility and superiority.

Key words： Portulaca oleracea L.；leaves of Ginkgo biloba L.；flavonoids； microorganism； DPPH

植物活性成分包括黃酮、多酚、生物堿、皂苷等，廣泛存在于植物的葉、根、莖、果實中，是綜合利用的植物資源。植物活性成分具有抗氧化、抗菌、預防或抑制腫瘤等生理功能。植物活性成分因其高的安全性，已滲入到食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[1，2]。因此，利用各種提取技術(shù)從植物中提取具有高活性的成分已經(jīng)成為目前的研究熱點。傳統(tǒng)的提取技術(shù)包括有機溶劑提取法、熱水提取法、系統(tǒng)溶劑提取法等，但產(chǎn)品安全性低、耗時長、提取率低。安全性高、提取率高和環(huán)保的新型提取方法越來越受人們的關(guān)注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生長過程中分泌的多種酶，從而對植物中的活性成分進行提取和修飾[3-7]。

本研究以2種提取黃酮較為普遍的馬齒莧（Portulaca oleracea L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）葉為對象，以乙醇提取和微生物提取作為對比，檢測提取液中總黃酮的含量和提取液對DPPH自由基的清除作用，初步探究微生物法提取植物中黃酮的可行性與優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 黃酒酵母，購自北京市食品釀造研究所。

1.1.2 供試材料 馬齒莧、銀杏葉，60 ℃烘干至恒重，粉碎過50目篩備用。

1.1.3 試劑 蘆丁標準品（生化試劑，中國藥品生物制品檢定所）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為市售國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機械廠）、全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉華美生化儀器廠）、水浴恒溫搖床（太倉華美生化儀器廠）、低速大容量臺式離心機、紫外分光光度計UV-1240（日本島津）等。

1.2 黃酮的提取

1.2.1 乙醇提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧和銀杏葉粉末，按照1∶50料液比（g∶mL，下同）， 加入體積分數(shù)為60%的乙醇250 mL，于70 ℃水浴搖床中提取3 h，冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清液待測[8-12]。

1.2.2 微生物法提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧粉和銀杏葉粉，按照1∶50的料液比，加入去離子水250 mL，接入5%的黃酒酵母擴培菌液，于28 ℃、180 r/min的空氣搖床中提取48 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.3 黃酮含量的測定

1.3.1 標準曲線的繪制 準確配制1 mg/mL蘆丁標準液，精確吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL蘆丁標準液，補齊至1 mL，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加0.4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以空白試劑為對照，在510 nm下測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標（x），以吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 黃酮提取率的測定 準確吸取1 mL的提取液，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，再加0.4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以提取溶劑作為空白對照，在510 nm下測其吸光度，由標準曲線計算出提取液中黃酮的含量。

黃酮提取率=提取液中黃酮含量×提取液總體積/原料質(zhì)量×100%

1.4 粗提液對DPPH自由基的清除作用

將提取液用提取溶劑稀釋梯度作為待測液，取等體積的待測液與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻為A1管；取等體積的無水乙醇與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻為A2管；取等體積的無水乙醇與待測液混勻為A3管。反應30 min后，在517 nm下測A1、A2、A3管吸光度[13-15]。清除率計算公式為：

清除率=[（A2+A3）-A1]/A2×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

對蘆丁標準液的濃度和吸光度進行線性回歸處理，計算得回歸方程：y=1.098 9x+0.006 6，R2=0.999 5（圖1）。

2.2 黃酮提取率

以體積分數(shù)為60%的乙醇溶液提取馬齒莧黃酮和銀杏葉黃酮，粗提液中黃酮的總質(zhì)量分別為99.81 mg和218.38 mg，提取率分別為2.00%和4.37%，以黃酒酵母提取馬齒莧黃酮和銀杏葉黃酮，粗提液中黃酮的總質(zhì)量分別為103.38 mg和241.98 mg，提取率分別為2.07%和4.84%（圖2和圖3），馬齒莧和銀杏葉的微生物提取黃酮的提取率在一定程度上均高于乙醇提取率。

2.3 粗提液對DPPH自由基的清除作用

馬齒莧和銀杏葉的乙醇提取液和微生物提取液對DPPH自由基的清除作用見圖4和圖5。從圖4和圖5中可以看出，相同的稀釋倍數(shù)馬齒莧和銀杏葉的微生物提取液對DPPH自由基的清除率均高于乙醇提取液，即微生物提取液的抗氧化性高于乙醇提取液的抗氧化性。

3 小結(jié)與討論

本研究采用乙醇提取和微生物提取的方式對馬齒莧和銀杏葉進行黃酮的提取，結(jié)果表明，微生物提取液中的黃酮含量高于乙醇的提取液，2種方法的提取液對DPPH自由基清除作用的測定結(jié)果表明，微生物提取液的清除作用要高于乙醇提取液，可初步表明微生物提取方式提取了更多的黃酮，提取液具有更高的抗氧化活性。微生物法不必使用有機試劑、溫度適中、對環(huán)境無污染，更環(huán)保，更有效。對馬齒莧和銀杏葉這2種植物的初步分析結(jié)果可為其他植物進行微生物提取黃酮或者其他活性成分提供參考和借鑒。

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