基于液體飼喂模式的褐飛虱取食行為監(jiān)測(cè)技術(shù)的研究

摘要：采用刺探電位圖（EPG）技術(shù)監(jiān)測(cè)褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）對(duì)人工取食液的取食行為，參考褐飛虱取食水稻的EPG波形，對(duì)褐飛虱取食Parafilm膜下液體狀物質(zhì)的EPG波形進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)褐飛虱在液體飼喂模型中產(chǎn)生5種典型波形，分別為非刺探波形（np波）、口針刺入波形（P波）、口針在液體中移動(dòng)波形（M波）、主動(dòng)抽吸波形（I波）和口針在液體中的未知波形（X波）。采用飼喂模式分析褐飛虱取食不同濃度蔗糖溶液的刺吸行為，發(fā)現(xiàn)褐飛虱對(duì)2.50%～20.00%濃度范圍的蔗糖溶液吸食時(shí)間較長(zhǎng)，尤其是5.00%和20.00%蔗糖組的褐飛虱有一半左右的記錄時(shí)間處于主動(dòng)吸食狀態(tài)。蔗糖溶液在用于褐飛虱EPG監(jiān)測(cè)的液體飼喂模式時(shí)，推薦5.00%～20.00%作為候選人工取食液濃度。

關(guān)鍵詞：褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）；液體飼喂模式；蔗糖；取食行為；刺探電位圖

中圖分類號(hào)：S435.112+3；S482.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）06-1374-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.024

Abstract： Electrical penetration graph （EPG） was used to monitor the probing and sucking behavior of brown planthopper feeding with artificial liquid diet. The corresponding EPG waveforms were identified using the EPG waveforms of brown planthopper feeding with rice plants as reference. It results showed that there were 5 typical waveforms on liquid diet model correlated with feeding behaviors including non-probe（np）， stylet penetrating into liquid （P）， stylet moving in liquid （M）， active ingestion of liquid （I） and unknown behavior of stylet in liquid （X）. The feeding behavior of brown planthopper feeding on sucrose solution of different concentrations was studied using EPG technique on the liquid diet model. The results showed that the total time of ingestion waveforms in groups of 2.50%～20.00% sucrose solution was longer than that of the control group （in fresh water）. The brown planthopper in groups of 5.00% and 20.00% sucrose solutions was in active ingestion at half of the recording time. Therefore， 5.00%～20.00% sucrose solution is recommended as the candidate diet for the EPG recording of brown planthopper feeding on the liquid diet model.

Key words：brown planthopper（Nilaparvata lugens Stal）； liquid diet model；sucrose；feeding behavior； electrical penetration graph（EPG）

褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）是中國(guó)及亞洲水稻的主要害蟲(chóng)，為典型的刺吸式昆蟲(chóng)，主要通過(guò)口針刺吸韌皮部汁液對(duì)水稻植株造成危害，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生水稻虱燒現(xiàn)象。褐飛虱的為害方式與其取食行為密切相關(guān)，其在植株上的取食行為已成為農(nóng)業(yè)有害昆蟲(chóng)研究的重要內(nèi)容。

使用昆蟲(chóng)取食監(jiān)測(cè)儀（刺探電位圖技術(shù)，Electronic penetration graph，EPG）是研究刺吸式昆蟲(chóng)（蚜蟲(chóng)、飛虱、葉蟬等）在植物組織內(nèi)部取食行為的一種精確、直觀的方法[1-3]。通過(guò)記錄刺吸式昆蟲(chóng)口針刺探和取食植物組織過(guò)程中產(chǎn)生的刺探電位波形特征，觀察昆蟲(chóng)在植物組織內(nèi)部的刺探和取食行為過(guò)程，能定量研究昆蟲(chóng)在植物組織內(nèi)部分泌唾液和刺吸汁液等取食行為。Mclean等[4]首次報(bào)道了刺探電位圖技術(shù)在豌豆蚜取食行為研究中的應(yīng)用，刺探電位圖技術(shù)在稻飛虱取食行為中的應(yīng)用研究始于20世紀(jì)80年代。刺探電位圖技術(shù)在褐飛虱取食行為中的刺吸波形所表示的生物學(xué)意義已越來(lái)越清楚[5-9]，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了褐飛虱在水稻品種上的取食行為及殺蟲(chóng)劑、化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境因素對(duì)褐飛虱取食的影響等研究[10-13]。

由于刺吸式口器昆蟲(chóng)與植物的相互關(guān)系比較復(fù)雜，昆蟲(chóng)口針在植物體內(nèi)的行為活動(dòng)多樣，EPG監(jiān)測(cè)時(shí)波形多樣且復(fù)雜，而刺吸式口器昆蟲(chóng)在取食人工飼料時(shí)口針行為較簡(jiǎn)單，人工飼料可以為EPG監(jiān)測(cè)定性或定量研究刺吸式口器昆蟲(chóng)取食行為提供單一且可重復(fù)的環(huán)境[14]。本研究采用EPG監(jiān)測(cè)褐飛虱對(duì)人工取食液的取食行為，參考褐飛虱取食水稻的EPG波形來(lái)解析人工取食液的EPG波形，并分析褐飛虱取食不同濃度蔗糖溶液時(shí)的刺吸行為差異，為基于液體飼喂的EPG監(jiān)測(cè)技術(shù)在褐飛虱取食行為研究中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

采用室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)的褐飛虱為供試蟲(chóng)源，選取羽化1～3 d的雌成蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)試。采用汕優(yōu)63水稻植株飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（27±1） ℃，光周期為16 h∶8 h（L∶D）。

1.2 褐飛虱取食Parafilm膜下液體的刺吸行為監(jiān)測(cè)

采用四通道面板控制直流電型（DC-EPG型）昆蟲(chóng)電子取食監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Parafilm膜封液體法，將50 mL塑料三角杯去底面，用Parafilm膜封住底面，疊至盛有溶液的另一個(gè)三角杯中，再將植物電極插入溶液，注意在膜和液面之間不要有氣泡。先用二氧化碳短時(shí)間（15 s）麻醉褐飛虱雌成蟲(chóng)（預(yù)先饑餓2 h），迅速用導(dǎo)電銀膠將一根細(xì)金線（直徑20 μm ，長(zhǎng)10 cm）的一端與褐飛虱胸背板黏連，另一端相連至昆蟲(chóng)電極。接通電流，使懸掛的試蟲(chóng)在Parafilm膜上能自由活動(dòng)，開(kāi)始記錄。分設(shè)清水對(duì)照組（蔗糖濃度0）和7個(gè)蔗糖濃度組，分別為1.25%、2.50%、5.00%、10.00%、20.00%、40.00%和60.00%。每個(gè)處理10次以上有效重復(fù)，每次記錄重復(fù)用不同的昆蟲(chóng)個(gè)體和溶液情況，記錄時(shí)間6 h。所有記錄均在室內(nèi)進(jìn)行，溫度為（26±1） ℃，相對(duì)濕度為70%±5%，光照條件為持續(xù)光照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS軟件的PROC MEANS程序算出試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用PROC GLM程序采用新復(fù)極差法檢驗(yàn)處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱取食Parafilm膜下液體的EPG波形

相對(duì)褐飛虱取食水稻植株的EPG波形而言[7]，褐飛虱取食Parafilm膜下液體狀物質(zhì)的EPG波形比較簡(jiǎn)單（圖1），出現(xiàn)了幾種典型波形。

np波：非刺探波形。褐飛虱口針未刺入膜，這段時(shí)間的電壓一般維持在0基線，有時(shí)會(huì)因?yàn)槔ハx(chóng)的活動(dòng)而出現(xiàn)在基線上下呈不規(guī)律的脈沖波形，如在400 s左右出現(xiàn)的脈沖波形（圖1A）。褐飛虱取食液體的np波形與取食水稻植株的np波形相似。

P波：開(kāi)始刺探波形。即口針刺破Parafilm膜的過(guò)程，此時(shí)電壓瞬時(shí)出現(xiàn)變化（圖1B）。該波形與取食水稻植株的N1波形基本一致，區(qū)別在于褐飛虱取食水稻植株的N1波形要比取食液體的P波形復(fù)雜，因?yàn)榭卺槾掏窹arafilm膜比刺破植物表皮要簡(jiǎn)單得多。

M波：口針在液體中移動(dòng)波形。此時(shí)沒(méi)有吸取液體，波形無(wú)規(guī)律（圖1B）。該波形與褐飛虱取食水稻植株的N2波形相似，不同的是M波形較簡(jiǎn)單且持續(xù)時(shí)間很短。

I波：持續(xù)吸食波形。波形有規(guī)律，波頻一般為5～6 Hz，波幅較大（圖1C）。該波形與褐飛虱取食水稻植株的N5波形相似，都屬于口針主動(dòng)吸食過(guò)程。

X波：未知波形。該波形不是每次記錄都出現(xiàn)，若出現(xiàn)往往是在較長(zhǎng)時(shí)間的I波形之后。從I波形至X波形電壓瞬間下降，由波峰和平坦波線交替組成（圖1D）。波峰間隔隨時(shí)間延長(zhǎng)而變大，剛開(kāi)始時(shí)每6～7 s就會(huì)出現(xiàn)一波峰，往后波峰間隔有時(shí)會(huì)達(dá)到50～60 s。

2.2 褐飛虱取食不同濃度蔗糖溶液的刺吸行為

EPG監(jiān)測(cè)褐飛虱雌成蟲(chóng)對(duì)Parafilm膜下清水和7個(gè)濃度蔗糖溶液的刺探和吸食行為，對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果（表1）進(jìn)行分析（表2）。無(wú)論是清水還是蔗糖溶液，褐飛虱取食都出現(xiàn)了“2.1”所述的幾種典型波形。表1列出在不同液體介質(zhì)情況下褐飛虱取食波形的主要特征。

np波總持續(xù)時(shí)間：即非刺探總時(shí)間。濃度為2.50%、5.00%和20.00%蔗糖組的np波總持續(xù)時(shí)間顯著小于清水組，1.25%、10.00%、40.00%和60.00%蔗糖組的np波總持續(xù)時(shí)間與清水組相當(dāng)。

P波出現(xiàn)次數(shù)：即記錄期間口針刺入次數(shù)。1.25%～20.00%蔗糖濃度范圍內(nèi)，刺入次數(shù)與清水組相當(dāng)，40.00%和60.00%蔗糖組口針刺入次數(shù)顯著增加。

M波總持續(xù)時(shí)間：M波為口針在液體內(nèi)但是尚未吸取液體時(shí)的表征，通常比較短暫。1.25%～20.00%蔗糖濃度范圍內(nèi)，該值與清水組相當(dāng)，40.00%和60.00%蔗糖組M波總持續(xù)時(shí)間顯著增加。該值在不同蔗糖濃度間有差異，表現(xiàn)出與口針刺入次數(shù)、蔗糖濃度相關(guān)聯(lián)。

I波總持續(xù)時(shí)間：即褐飛虱主動(dòng)抽吸液體過(guò)程的總時(shí)間。1.25%、40.00%和60.00%蔗糖組的褐飛虱吸食時(shí)間與清水組相當(dāng)，在蔗糖濃度5.00%～20.00%范圍內(nèi)的吸食時(shí)間明顯多于清水。圖2直觀顯示了不同濃度蔗糖溶液I波形總持續(xù)時(shí)間在總監(jiān)測(cè)時(shí)間中的占比，5.00%和20.00%蔗糖組的褐飛虱有一半左右的記錄時(shí)間處于主動(dòng)吸食狀態(tài)。

I波出現(xiàn)次數(shù)：即褐飛虱主動(dòng)抽吸液體的次數(shù)。隨著蔗糖濃度的增加，I波出現(xiàn)次數(shù)有增加趨勢(shì)。

X波總持續(xù)時(shí)間：X波為跟隨I波之后出現(xiàn)的未知波形。該值在不同濃度間有顯著差異，40.00%和60.00%蔗糖組的X波持續(xù)間短，1.25%蔗糖組的X波時(shí)間長(zhǎng)。試驗(yàn)中該波形在不同重復(fù)間出現(xiàn)很大差異，如20.00%蔗糖組10次有效重復(fù)中僅1次記錄中出現(xiàn)X波形，而2.50%蔗糖組15次有效重復(fù)中有10次記錄中出現(xiàn)X波形。X波形的出現(xiàn)似乎與I波形持續(xù)時(shí)間有關(guān)，但是尚未發(fā)現(xiàn)其具有明顯的規(guī)律性。

對(duì)褐飛虱雌成蟲(chóng)在Parafilm膜下液體的刺吸波形進(jìn)行了解析，并通過(guò)EPG監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)褐飛虱成蟲(chóng)對(duì)2.50%～20.00%濃度范圍的蔗糖溶液取食時(shí)間較長(zhǎng)。

3 小結(jié)與討論

結(jié)合液體飼喂的EPG監(jiān)測(cè)技術(shù)已在多種昆蟲(chóng)研究中應(yīng)用[15-17]。金亮等[13]為研究植物源化合物對(duì)褐飛虱取食行為的影響，采用EPG監(jiān)測(cè)了褐飛虱口針對(duì)液態(tài)人工飼料的刺探行為，定義了5種波形，分別為N1波、N2波、N3波、E波以及非刺探波np波。其中np波、N1波、N2波和E波與本研究的np波、P波、M波和I波是基本一致的，但本研究沒(méi)有解析到N3波形，金亮等沒(méi)有解析到X波形。N1波、N2波和N3波的命名源自褐飛虱取食水稻植株的波形[6]，N3波即褐飛虱口針刺入篩管的過(guò)程，因?yàn)樗卷g皮部外圍有厚壁細(xì)胞，篩管旁還有伴胞，所以褐飛虱口針在進(jìn)入篩管吸取汁液之前要穿透厚壁細(xì)胞和伴胞，會(huì)出現(xiàn)波幅很大的周期性波峰。取食Parafilm膜下液體時(shí)沒(méi)有這種穿透過(guò)程，也應(yīng)該沒(méi)有N3波形，金亮等[13]觀測(cè)到的N3波根據(jù)其提供的波形圖來(lái)看，應(yīng)該屬于N2波。本研究中的X未知波形與Trebicki等[16]所描述的南斑葉蟬（Orosius orientalis）取食液態(tài)飼料的O3波形極其相似。南斑葉蟬的O3波形通常跟隨在O2波形（在木質(zhì)部?jī)?nèi)主動(dòng)抽吸波形）之后出現(xiàn)，且其特征與本研究中的X波形相近，均由間斷出現(xiàn)的尖峰和平坦起伏的信號(hào)組合而成，而且波峰的頻率很?。?.02～0.05 Hz），O3波形也是隨機(jī)出現(xiàn)，其出現(xiàn)頻率明顯要小于O2，這些與本研究中的X波形基本一致。相似的波形也在另一種葉蟬Cicadulina mbila的研究中出現(xiàn)[16]，但該種波形的刺探屬性和口針位置尚不清楚。褐飛虱取食液態(tài)人工飼料時(shí)X波形的生物學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。X波形不經(jīng)常出現(xiàn)，而且其出現(xiàn)的持續(xù)時(shí)間和次數(shù)不成規(guī)律，不會(huì)過(guò)多影響到采用液體飼喂模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)褐飛虱取食行為的應(yīng)用研究。

對(duì)于液體飼喂模式中的液體物質(zhì)及其濃度的選擇[6，17]，簡(jiǎn)單的蔗糖飼料因其單一方便，且能基本滿足短期內(nèi)昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)需要，可以用于短期的觀測(cè)試驗(yàn)（如以EPG記錄為目的的研究）。如果長(zhǎng)期飼養(yǎng)或以觀測(cè)存活率為目的的研究就需要用較高營(yíng)養(yǎng)成分要求的飼料來(lái)替代單一的蔗糖。對(duì)于EPG研究中蔗糖溶液濃度的選擇應(yīng)根據(jù)昆蟲(chóng)種類的不同而有所差異。已有采用生測(cè)方法觀察褐飛虱對(duì)不同濃度蔗糖攝取量的報(bào)道[18]，但鮮見(jiàn)在EPG研究中褐飛虱對(duì)不同濃度蔗糖的取食反應(yīng)的報(bào)道。本研究監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)褐飛虱對(duì)5.00%～20.00%的蔗糖溶液取食時(shí)間最長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的褐飛虱對(duì)20.00%蔗糖溶液攝取量最大的結(jié)果基本對(duì)應(yīng)。因此用于研究褐飛虱取食行為的液體飼喂可以采用5.00%～20.00%的蔗糖溶液作為液體飼料。

由于刺吸式口器昆蟲(chóng)與植物相互關(guān)系復(fù)雜，昆蟲(chóng)口針對(duì)植物的行為活動(dòng)多樣，EPG監(jiān)測(cè)時(shí)波形多樣且復(fù)雜，而刺吸式口器昆蟲(chóng)在取食人工飼料時(shí)口針行為較簡(jiǎn)單，取食人工飼料的EPG監(jiān)測(cè)可以為定性或定量研究刺吸式口器昆蟲(chóng)取食行為提供單一且可重復(fù)的環(huán)境[14]。本研究采用EPG監(jiān)測(cè)褐飛虱對(duì)人工取食液的取食行為，參考褐飛虱取食水稻的EPG波形來(lái)解析人工取食液的EPG波形，并分析褐飛虱取食不同濃度蔗糖的刺吸行為，為基于液體飼喂的EPG監(jiān)測(cè)技術(shù)在褐飛虱取食行為研究上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。根據(jù)不同研究目的，液體飼喂的EPG記錄時(shí)間可以有所不同。由于沒(méi)有植物表面復(fù)雜的生物和化學(xué)等刺激因素，褐飛虱在人工液體飼喂條件下適應(yīng)和刺探嘗試要耗費(fèi)更長(zhǎng)的時(shí)間，根據(jù)試驗(yàn)觀察，6 h以上的記錄時(shí)間對(duì)于液體飼喂的褐飛虱是合適的。

使用液態(tài)人工飼料裝置與使用活體植株相比有更多的優(yōu)勢(shì)，取食液結(jié)構(gòu)均一、簡(jiǎn)單，因而刺探波形種類較少，波形識(shí)別更簡(jiǎn)單可靠，避免了植物個(gè)體差異所帶來(lái)的影響，能夠更直接地反映刺吸昆蟲(chóng)取食行為。由于蔗糖溶液中添加生物活性物質(zhì)能夠方便地研究單一物質(zhì)的作用，因此利用液體飼喂的EPG監(jiān)測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)對(duì)刺吸式口器昆蟲(chóng)的影響已經(jīng)成為生物活性物質(zhì)作用研究中比較有效的方法。對(duì)褐飛虱在液體飼喂模式下的取食行為監(jiān)測(cè)可為褐飛虱取食行為研究提供候選的試驗(yàn)?zāi)Ｊ?，該模式可以廣泛用于研究殺蟲(chóng)劑、其他化學(xué)物質(zhì)、植物次生代謝物質(zhì)以及環(huán)境因素等對(duì)褐飛虱取食行為的影響等方面。

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