梵凈山野生蝴蝶花總黃酮提取工藝優(yōu)化

摘要：為了探索梵凈山野生蝴蝶花（Iris japonica）總黃酮的最佳提取工藝條件，采用單因素和正交試驗方法，以料液比（g∶mL）、乙醇體積分數(shù)、浸提溫度和提取時間4個因素進行試驗。結果表明，梵凈山蝴蝶花總黃酮提取的最適宜工藝條件為料液比1∶30，以90%乙醇為提取溶劑，浸提溫度80 ℃，超聲波提取40 min，該條件下蝴蝶花總黃酮提取率為4.29%。該工藝可為梵凈山蝴蝶花的綜合利用提供科學依據(jù)和技術支持。

關鍵詞：蝴蝶花（Iris japonica）；總黃酮；工藝優(yōu)化

中圖分類號：R284.2；S681.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1458-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.045

Abstract： The process of extracting total flavonoids from Iris japonica in Fanjing mountain was optimized with single factor experiment and orthogonal test. The ratio of material and solvent， volume fraction of ethanol， temperature and time were selected as experiment factors. The results showed that the optimal conditions of extracting total flavonoids from I. japonica were the material and liquid ratio of 1∶30（g∶mL）， 70% ethanol as extracting solvent， 40 min， 80 ℃. Under these conditions， extraction rate of total flavonoids was 4.29%. It will provide valuable reference for comprehensively utilizing of I. japonica in Fanjing mountain.

Key words：Iris japonica； total flavonoids； process optimization

蝴蝶花（Iris japonica）是鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物。根莖匍匐狀，有長分枝，具有清熱解毒、消腫止痛的功效且有小毒[1]。根狀莖在民間作為土藥長期使用，主要用于治療肝炎、食積脹滿、咽喉腫痛、跌打損傷、子宮脫垂和蛇犬咬傷等[2]。蝴蝶花作為民族醫(yī)藥，主要用于治療肝氣郁結[3，4]。目前，對蝴蝶花的研究主要集中在生物學特性[5，6]、異黃酮的提取[7]、園林應用[8，9]、病蟲害[10]、花形態(tài)可塑性[11]和組織培養(yǎng)[12]等方面。在化學成分的研究上，對同屬植物射干的鳶尾苷、鳶尾酮和異黃酮的研究較多[13-15]，有學者對蝴蝶花的鳶尾苷和鳶尾酮進行了研究[16，17]。蝴蝶花在貴州省產(chǎn)量較大，山上各處均有野生植株，而且藥用價值大，為進一步開發(fā)利用其種質(zhì)資源，本試驗首次對蝴蝶花的總黃酮提取工藝進行了優(yōu)化，旨在為蝴蝶花資源的綜合開發(fā)和利用提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 采自梵凈山保護區(qū)周邊，經(jīng)鑒定為蝴蝶花。將材料洗凈、置于70 ℃烘箱干燥，粉碎，過60目篩，待用。

1.1.2 試劑 蘆丁，天津市光復精細化工有限公司；氫氧化鈉，天津石英鐘廠霸州市化工分廠；硝酸鋁，天津市恒興化學試劑制造有限公司；亞硝酸鈉，成都金山化學試劑有限公司；無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司。以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設備 80-2型離心機，江蘇金壇市中大儀器廠；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；SG5200HPT型臺式超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司；T6型新世紀紫外可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取 稱取樣品粉末0.500 0 g于100 mL三角瓶中，以一定體積分數(shù)的乙醇作為浸提試劑，在一定溫度下進行超聲波浸提30 min，3 000 r/min離心10 min，上清液轉入100 mL容量瓶，加入0.05 g/mL亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min，加入0.1 g/mL硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加0.04 g/mL氫氧化鈉4 mL，用去離子水定容至刻度，搖勻，放置15 min后，在分光光度計510 nm波長下測定吸光度[18]。

1.2.2 標準曲線的繪制 以蘆丁為標準品，采用蒽酮比色法測定總黃酮含量[19]，標準曲線見圖1。標準曲線方程為y=0.015 8x-0.000 7，R2=0.999 1。

1.2.3 提取條件的優(yōu)化 精確稱取蝴蝶花粉末0.500 0 g若干份，考察料液比（g∶mL，下同）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；乙醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%；浸提溫度分別為40、50、60、70、80 ℃；提取時間分別為10、20、30、40、50 min對總黃酮提取率的影響，采用L9（34）進行正交試驗，通過正交分析得出總黃酮最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比 不同料液比對總黃酮提取率的影響見圖2。由圖2可知，當料液比為1∶10時，總黃酮提取率最低（1.14%）；隨著料液比的降低，總黃酮的提取率呈持續(xù)上升的趨勢，當料液比為1∶30時，提取率最高（2.39%），原因可能是料液比的降低增大了傳質(zhì)動力。當料液比低于1∶35時，蝴蝶花的總黃酮提取率呈下降趨勢，可能是由于料液比的降低反而不利于總黃酮的充分浸出。所以，最適料液比是1∶30。

2.1.2 乙醇體積分數(shù) 不同乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響見圖3。由圖3可知，當乙醇體積分數(shù)為40%時，蝴蝶花總黃酮的提取率最低（1.55%）；隨著乙醇體積分數(shù)的增大，總黃酮提取率呈持續(xù)上升的趨勢。當乙醇體積分數(shù)為80%時，提取率最高（3.74%）；當乙醇體積分數(shù)為90%時，蝴蝶花總黃酮的提取率下降。因此80%乙醇是最佳的提取溶劑。

2.1.3 浸提溫度 不同浸提溫度對總黃酮提取率的影響見圖4。由圖4可知，當浸提溫度為40 ℃時，蝴蝶花總黃酮的提取率為2.79%；當溫度為50 ℃時，總黃酮的提取率下降為2.58%，具體原因有待進一步研究。隨著溫度的繼續(xù)升高，蝴蝶花總黃酮的提取率又呈上升趨勢。當溫度為70 ℃時，總黃酮的提取率最高（3.55%），說明溫度的升高，對細胞的破壞作用變大，這樣有利于總黃酮的浸出。當浸提溫度超過70 ℃時，總黃酮的提取率下降，可能是由于溫度過高，總黃酮的活性和結構發(fā)生了變化，導致總黃酮部分分解，造成提取率下降。所以最適宜的浸提溫度為70 ℃。

2.1.4 提取時間 不同提取時間對總黃酮提取率的影響見圖5。由圖5可知，當提取時間為10 min時，總黃酮的提取率最低（2.16%）；隨著提取時間的延長，蝴蝶花總黃酮的提取率呈上升趨勢。當提取40 min時，總黃酮的提取率達到最大值（2.45%），說明提取時間和總黃酮的提取率有著密切的關系，在提取40 min內(nèi)，增加超聲波時間，有利于總黃酮的溶解和擴散，但提取超過40 min后，蝴蝶花總黃酮的提取率呈下降趨勢，可能是由于超聲波時間過長，總黃酮部分分解，導致提取率下降。所以，最佳提取時間是40 min。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇料液比、乙醇體積分數(shù)、浸提溫度和提取時間4個因素進行L9（34）正交試驗，試驗結果見表2。由表2極差分析可知，4個因素對蝴蝶花總黃酮提取效果的影響依次為D、C、A、B，即提取時間>浸提溫度>料液比>乙醇體積分數(shù)，最佳工藝組合為A2B3C3D2，即料液比為1∶30， 90%乙醇，浸提溫度80 ℃，超聲波提取40 min。在此工藝條件下進行驗證，總黃酮的提取率為4.29%，高于正交組合A3B1C3D2的4.26%，表明該方法可行。

3 小結與討論

梵凈山蝴蝶花總黃酮提取工藝的4個因素中，提取時間的影響最大，浸提溫度次之，乙醇體積分數(shù)的影響最小。本試驗在最佳的工藝條件下總黃酮的提取率為4.29%，與楊紅玲等[20]、李英娜等[21]對射干黃酮提取的得率9.841%和7.27%相比較低。經(jīng)單因素和正交試驗得出，提取梵凈山蝴蝶花總黃酮的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶30、90%乙醇、浸提溫度80 ℃，超聲波提取40 min，此時總黃酮提取率為4.29%。該工藝具有操作性強，穩(wěn)定性好和成本較低等特點，可為梵凈山野生蝴蝶花開發(fā)和利用提供理論技術支持。

本研究采用單因素和正交試驗的方法，用蘆丁作為標準品，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH作顯色劑，標準曲線方程R2=0.999 1，線性關系良好，說明該工藝穩(wěn)定性好。

本研究僅對乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和浸提溫度4個因素進行了初步試驗，影響蝴蝶花總黃酮的提取率還有很多因素[22]，如提取試劑、方法、次數(shù)和采收季節(jié)等，今后還需對這些因素進行綜合分析和研究。蝴蝶花作為貴州民族醫(yī)藥，其化學成分研究尚未深入開展，究竟是哪些成分作為民族醫(yī)藥的藥用成分發(fā)揮作用還是未知，今后還需進行深入研究。

參考文獻：

[1] 中國藥材公司.中國中藥資源志要[M].北京：科學出版社，1994.

[2] 云雪林，楊碧仙.貴州鳶尾屬植物種質(zhì)資源及觀賞藥用價值[J]. 貴陽學院學報（自然科學版），2009（3）：15-17.

[3] 雷啟榮，羅 君，趙琳珺，等.鳶尾的化學成分和藥理作用的研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011（12）：41-42.

[4] 中國科學院.中國植物志[M].北京：科學出版社，1985.

[5] 蔡仕珍，李 西，潘遠智，等.不同光照對蝴蝶花光合特性及生長發(fā)育研究[J].草業(yè)學報，2013（2）：264-272.

[6] 王永健，鐘章成，陶建平.縉云山不同生境蝴蝶花（Iris japonica Thumb.）分株種群格局及對草本多樣性的影響[J].生態(tài)學報，2008（7）：3082-3091.

[7] 李宇偉，王文靜，連瑞麗.正交試驗法優(yōu)選鳶尾異黃酮的提取工藝[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2010，49（5）：1180-1182.

[8] 郭晉燕，張金政，孫國峰，等.根莖鳶尾園藝學研究進展[J].園藝學報，2006（5）：1149-1156.

[9] 鄧曉梅，付素靜，王 浪.蝴蝶花的特征特性及栽培技術[J].安徽農(nóng)學通報，2014（15）：57-62.

[10] 宿巧燕.蝴蝶花枯斑病病原鑒定及其生物學特性研究[D]. 重慶：西南農(nóng)業(yè)大學，2003.

[11]李青雨，鐘章成，何躍軍.土壤養(yǎng)分對蝴蝶花的花形態(tài)可塑性的影響[J].武漢植物學研究，2005，23（6）：564-567.

[12] 趙宏波，陳發(fā)棣，房偉民，等.蝴蝶花的組織培養(yǎng)和根狀莖的誘導[J].園藝學報，2005，32（3）：556-557.

[13] 段麗紅，郭祀遠，鄭必勝.從射干中提取射干中鳶尾苷的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006（1）：70-71.

[14] 郭 濤，楊克迪，陳 鈞.鳶尾中鳶尾酮的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機分析[J].食品科學，2005（1）：172-176

[15] 秦民堅，吉文亮，王崢濤.HPLC測定射干中6種異黃酮含量的動態(tài)變化[J].中國中藥雜志，2006（20）：1681-1683.

[16] 秦民堅，王 強，巫弘罡，等.鳶尾科藥用根莖類16種植物的異黃酮含量測定[J].植物資源與環(huán)境，1996（4）：57-58.

[17] 郭 濤，楊克迪，陳 鈞，等.鳶尾中鳶尾酮的鑒定及含量測定[J].中草藥，2004（8）：34-36.

[18] 王 嵐，吳定軍，魯?shù)劳?梵凈山七葉一枝花總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2014，45（4）：634-638.

[19] 張志良，瞿偉菁，李小方.植物生理學實驗指導[M]. 第4版. 北京：高等教育出版社，2009.

[20] 楊紅玲，吳鳴建，張宏韜，等.射干黃酮提取工藝的響應面設計優(yōu)化[J].食品科技，2009，34（3）：188-192.

[21] 李英娜，張國剛，毛德雙，等.射干總黃酮的提取工藝研究[J].中南藥學，2007，5（6）：509-511.

[22] 趙 玥，李國信.HPLC法測定不同采收期鳶尾科3種植物中有效活性成分含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012（11）：39-41.