大花杓蘭內(nèi)生真菌多樣性研究

摘要：對大花杓蘭（Cypripedium macranthum Sw.）內(nèi)生真菌類群組成及多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從大花杓蘭植株中分離到內(nèi)生真菌59 株，利用ITS-rDNA序列分子鑒定法將大花杓蘭內(nèi)生真菌鑒定為18 個分類單元，分布在7綱9目11科16屬。北京大花杓蘭內(nèi)生真菌包括12個屬，內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)H=1.39、D=0.96，優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬（Chaetomium）和莖點霉屬（Phoma）真菌，分別占總菌株數(shù)的15.25%和8.47%；吉林大花杓蘭樣品內(nèi)生真菌歸于9個屬，內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)H=1.31、D=0.93，以毛殼菌屬（Chaetomium）為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)的23.73%。由此可見，北京大花杓蘭中內(nèi)生真菌多樣性高于吉林大花杓蘭。

關(guān)鍵詞：大花杓蘭（Cypripedium macranthum Sw.）；內(nèi)生真菌；分離；鑒定；多樣性

中圖分類號：Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1357-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.019

Abstract： The composition and diversity of endophytic fungal taxa in Cypripedium macranthum Sw was analyzed. The results showed that a total of 59 fungal strains were isolated from C. macranthum. These fungi were belonged to 18 taxa containing 7 classes， 9 orders， 11 families and 16 generas with analyzing ITS-rDNA sequence. Endophytic fungal groups in Beijing C. Macranthum included to 12 generas， with the diversity index H of 1.39 and D of 0.96. Chaetomium（15.25%） and Phoma （8.47%） were two major fungal groups. Endophytic fungal groups in Jilin C. Macranthum included 9 generas， with the diversity index H of 1.31 and D of 0.93.Chaetomium belonged to the core group（23.73%）. Diversity of endophytic fungi in Beijing C. Macranthum was higher than that of Jilin C. Macranthum.

Key words：Cypripedium macranthum； endophytic fungi； isolation； identification； diversity

大花杓蘭（Cypripedium macranthum Sw.）為蘭科杓蘭屬植物，其花大而艷麗，不僅是名貴的觀賞花卉，還是瀕危緊缺的藥用植物，對全身浮腫、小便不利、風(fēng)濕性腰腿痛、帶下及跌打損傷等具有治療作用[1]，療效確切，經(jīng)濟(jì)價值很高。由于該植物的生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，資源幾近枯竭。大花杓蘭的繁殖率很低，雖可以產(chǎn)生大量的成熟種子，但因不含胚乳，自然條件下極難萌發(fā)。研究表明，幾乎所有蘭科植物均與真菌形成共生關(guān)系，很多內(nèi)生真菌能促進(jìn)蘭科植物的種子萌發(fā)，加快植株的生長，提高繁殖率，增加宿主抗逆性，產(chǎn)生許多藥用成分和新化合物等。通過對大花杓蘭內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行研究，以期更加深入地了解大花杓蘭與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系，為利用內(nèi)生真菌促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)和生長，實現(xiàn)大花杓蘭的快速繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為大花杓蘭，分別采自北京市房山區(qū)百花山和吉林省通化縣富江鄉(xiāng)。

1.2 培養(yǎng)基

所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂12 g，去離子水1 000 mL）。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)生真菌的分離 隨機(jī)選取大花杓蘭健康的根、莖、葉，用清水洗凈，切成1 cm左右小段。采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗，3% 次氯酸鈉浸泡消毒，根、莖、葉消毒時間分別為2 min、4 min、1 min。無菌條件下，將材料剪成0.2 cm小段，置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)。待組織長出真菌菌絲，挑取菌絲先端接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)完成后，4 ℃保藏。

1.3.2 內(nèi)生真菌的純化 將PDA斜面培養(yǎng)基保藏的內(nèi)生真菌接種至PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)6～7 d，根據(jù)內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征，合并形態(tài)一致的菌株。

1.3.3 內(nèi)生真菌的分子鑒定 內(nèi)生真菌依據(jù)rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列進(jìn)行分子鑒定。內(nèi)生真菌DNA提取采用CTAB法[2]，用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[3]擴(kuò)增ITS1，5.8S和ITS2的全序列。PCR反應(yīng)體系50 μL：10×PCR Buffer 5 ？滋L，25 mmol/L MgCl2 1 ？滋L ， 10 mmol/L dNTP 2 ？滋L ，10 ？滋mol/L上下游引物各1.5 ？滋L ，1.0 U/μL Taq酶 2 ？滋L ，5 ？滋g/mL DNA模板2 ？滋L，ddH2O 35 ？滋L。PCR熱循環(huán)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性l min，55 ℃引物復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃充分延伸8 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。將不同真菌的ITS序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，尋找與查詢序列相似性大于95%[4]的rDNA ITS序列，利用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行全序列比對[5]，用Paup* 4b10軟件[6]進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建最大鄰接樹。根據(jù)聚類結(jié)果，對內(nèi)生真菌進(jìn)行分子鑒定。

1.3.4 大花杓蘭內(nèi)生真菌多樣性分析 度量在一個特定的植物組織樣品中內(nèi)生真菌的豐度，采用分離頻率和多樣性指數(shù)等指標(biāo)[7，8]。分離頻率可以反映出某種真菌在植物中出現(xiàn)的頻率，多樣性指數(shù)反映每種植物內(nèi)生真菌的物種多樣性程度。

分離頻率（isolation frequency，IF）：分離到的某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占分離內(nèi)生真菌總菌株數(shù)的百分率。

Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H），H=-Σ（Pi）（lnPi）；Simpson多樣性指數(shù)（D），D=1-Σ（Pi）2，式中Pi為給定的菌種i的菌株數(shù)量占真菌總數(shù)量的比例。

采用Sorenson（Cs）相似性系數(shù)比較兩地之間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。Cs=2j/（a+b），式中，j為兩個樣地共有種數(shù)或?qū)贁?shù)；a和b分別為樣地A和樣地B的物種數(shù)或?qū)贁?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離與鑒定

從大花杓蘭材料中共分離出59株內(nèi)生真菌，對各菌株及與其ITS序列相似性大于95%的已知真菌的ITS序列進(jìn)行BLAST分析，構(gòu)建最大鄰接樹，獲得與待測菌株聚在同一分支且相似性最大的已知真菌。根據(jù)序列相似性原則[9]，進(jìn)行菌種的鑒定，若相似性≥99%，可鑒定到種；相似性為95%～99%，可鑒定到屬；相似性<95%，可鑒定到科。59株內(nèi)生真菌中57株分別歸于16個屬，有1株內(nèi)生真菌只能鑒定到綱，為糞殼菌綱（Sordariomycetes）真菌，另有1株內(nèi)生真菌只能鑒定到科，為肉座菌科（Hypocreaceae）真菌。其中，毛殼菌屬（Chaetomium）和莖點霉屬（Phoma）真菌為優(yōu)勢菌群，分別占總菌株數(shù)的38.98%和10.17%（表1）。

2.2 內(nèi)生真菌的分布

2.2.1 不同器官內(nèi)生真菌的分布 不同地區(qū)的大花杓蘭不同器官內(nèi)生真菌的數(shù)量具有一定差異，北京百花山大花杓蘭共分離出28株內(nèi)生真菌，其中根中分離出18株，莖中分離出7株，葉片中分離出3株。吉林通化大花杓蘭共分離出31株真菌，其中根中分離出23株，莖中分離出5株，葉片中分離出3株。由此可見，大花杓蘭根中內(nèi)生真菌的數(shù)量高于其他部位，而葉中的數(shù)量最少。

2.2.2 不同地區(qū)大花杓蘭內(nèi)生真菌的分布 北京大花杓蘭樣品內(nèi)生真菌的種類比吉林大花杓蘭樣品多，北京大花杓蘭內(nèi)生真菌歸屬于12 個屬和1個科，優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬和莖點霉屬真菌，分別占總菌株數(shù)的15.25%和8.47%；吉林大花杓蘭樣品內(nèi)生真菌歸屬于9個屬和1個綱，以毛殼菌屬為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)的23.73%（表1）。有5個屬的真菌均在兩地的大花杓蘭中出現(xiàn)，兩個樣地內(nèi)生真菌組成相似性系數(shù)Cs=0.43，說明北京和吉林兩地大花杓蘭內(nèi)生真菌組成具有一定的相似性。

2.3 大花杓蘭內(nèi)生真菌多樣性

多樣性指數(shù)主要與內(nèi)生真菌的種類數(shù)量和個體分配的均勻性有關(guān)。北京大花杓蘭內(nèi)生真菌的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)H=1.39，Simpson多樣性指數(shù)D=0.96；吉林大花杓蘭內(nèi)生真菌的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)H=1.31，Simpson多樣性指數(shù)D=0.93；兩地大花杓蘭內(nèi)生真菌的多樣性存在差異，北京大花杓蘭內(nèi)生真菌的多樣性略高于吉林大花杓蘭內(nèi)生真菌。

3 小結(jié)與討論

植物內(nèi)生真菌的分離多采用組織分離法，即將表面消毒后的植物組織置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，繼而分離內(nèi)生真菌，根據(jù)宏微觀形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法鑒定菌種，進(jìn)行多樣性分析。任何一種培養(yǎng)基均具有選擇性，不能將植物組織中所有內(nèi)生真菌分離出來，這也是植物內(nèi)生真菌研究的困境[10]，采用宏基因組測序分析法能更好體現(xiàn)植物組織中內(nèi)生真菌的種類，但不能將內(nèi)生真菌分離出來，所以組織分離法尚為當(dāng)前獲得植物內(nèi)生真菌的主要方法。

本研究采用組織分離法從大花杓蘭植株中分離得到內(nèi)生真菌59株，利用ITS-rDNA序列分子鑒定的方法將其鑒定為18個分類單元，分布在7個綱9個目11科16個屬，優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬（Chaetomium）和莖點霉屬（Phoma）真菌。喬元寶[11]在扁脈杓蘭內(nèi)生真菌多樣性研究中也發(fā)現(xiàn)扁脈杓蘭中有毛殼菌屬、叢赤殼屬、鐮孢菌屬、鏈格孢屬、小鬼傘屬和木霉屬真菌的存在。張亞平[12]從大花杓蘭根中也分離得到毛殼菌屬、枝孢菌屬、光黑殼屬、Leptodontidium、鐮孢菌屬、木霉屬、青霉屬真菌，從山西杓蘭根中同樣分離到了Leptodontidium和毛殼菌屬真菌，在紫點杓蘭根中亦獲得Leptodontidium屬真菌。除上述類群的真菌外，杓蘭屬植物內(nèi)生真菌還涉及到另外20個屬的真菌[11，12]，可見杓蘭屬植物內(nèi)生真菌存在豐富的多樣性。

大花杓蘭不同器官內(nèi)生真菌的數(shù)量存在一定的差異，根中分離到的內(nèi)生真菌較莖和葉中多，葉中最少，可能與大花杓蘭為多年生草本植物有關(guān)。北京大花杓蘭和吉林大花杓蘭中只有5個屬的真菌同時存在，兩采樣地的大花杓蘭內(nèi)生真菌多樣性存在差異，與張亞平[12]分離得到的大花杓蘭內(nèi)生真菌的類群同樣存在差異，可見同一種植物在不同生境下具有不同的內(nèi)生真菌群落組成，其多樣性受生境影響較大。這一點與Pecoraro等[13]對蘭科石豆蘭屬植物內(nèi)生真菌的研究結(jié)果相似。

植物中蘊(yùn)藏著豐富的內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌在植物中的分布受組織、年齡結(jié)構(gòu)、生境等因素的影響， 其多樣性的研究往往受到內(nèi)生真菌分離方法的制約。因此，在隨后的蘭科植物內(nèi)生真菌研究中，應(yīng)綜合考慮這些因素，全面調(diào)查蘭科植物內(nèi)生真菌多樣性，獲得大量的內(nèi)生真菌資源，為進(jìn)一步尋找蘭科植物促生真菌以及篩選內(nèi)生真菌來源的生物活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

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