益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織內(nèi)SOD和MDA含量的影響

楊宇 夏建龍△ 陳剛 楊挺 蔡平

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210046)

益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織內(nèi)SOD和MDA含量的影響

楊宇1夏建龍1△陳剛2楊挺1蔡平2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210046)

目的 觀察不同濃度的益氣活血方對大鼠慢性脊髓壓迫后受損脊髓組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影響。方法 60只SD大鼠，隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組。其余50只造模，術(shù)后1 d根據(jù)脊髓功能評分將其分為：A組:造模后，以不同濃度的益氣活血方進(jìn)行灌胃；B組：造模后，以頸復(fù)康進(jìn)行灌胃；C組：造模后，以生理鹽水進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃4周后，采用ELISA方法測定大鼠受損節(jié)段中SOD和MDA含量。結(jié)果 不同濃度的益氣活血方及頸復(fù)康顆粒均能顯著增加大鼠受損脊髓組織內(nèi)SOD的含量(P<0.05)；中藥高濃度、中藥中濃度以及頸復(fù)康顆粒均能顯著降低MDA的含量(P<0.05)；中藥低濃度也能降低MDA含量，但與NS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 益氣活血方能有效提高受損脊髓組織細(xì)胞中氧自由基的清除率，促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。

益氣活血方； 大鼠； 脊髓型頸椎??； 超氧化物歧化酶； 丙二醛

脊髓型頸椎病(cervical spondylotic myelopathy, CSM)是由于頸椎間盤退變及突出、椎體后緣及鉤椎關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生、后縱韌帶骨化、黃韌帶肥厚或鈣化導(dǎo)致脊髓受壓、缺血，繼而出現(xiàn)脊髓功能障礙的疾病。本病好發(fā)于中老年人，發(fā)病率為人群的10%～15 %,男性多見，常因天氣變化、寒冷刺激、勞累等原因誘發(fā)。CSM屬中醫(yī)學(xué)中的“痹”“痿”等證范疇。益氣活血方以圣愈湯為主方,原方出自《脈因證治·金瘡》卷四，為著名醫(yī)家朱震亨所創(chuàng)。導(dǎo)師在臨床中以該方為基本方隨癥加減，靈活運(yùn)用于治療CSM并改善CSM術(shù)后的脊髓功能狀態(tài)。益氣活血方由黃芪、陳皮、甘草、桂枝、 羌活、丹參、茯苓、當(dāng)歸等14味中藥組成，具有益氣活血、利水消腫、通絡(luò)止痛之功效，對治療該病具有很好的療效,且服用安全、方便。目前關(guān)于中藥治療CSM的臨床研究已有很多,但從炎癥及抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制來探討防治CSM的報道較少。作者采用大鼠自體第七頸椎棘突椎間移植法制造大鼠脊髓壓迫模型來觀察益氣活血方能否通過抑制氧自由基的表達(dá)及促進(jìn)SOD的產(chǎn)生，達(dá)到抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的目的，以期為益氣活血方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

黃芪、陳皮、甘草、桂枝、 羌活、丹參、茯苓、當(dāng)歸、蜈蚣、延胡索、地龍、獨(dú)活、澤蘭、葛根、生理鹽水、酒精、碘伏、青霉素，均購自江蘇省中醫(yī)院；純水；10 %水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20140115)；頸復(fù)康(益豐大藥房，批號：490283)；SOD和MDA試劑盒購于南京建成生物研究所并由其研究所代測。

1.2 動物

SD大鼠60只，雌雄兼?zhèn)洌w質(zhì)量(200±2 ) g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SPF級，許可證號: SCXK(京)2012-0001。

1.3 器械及儀器

刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無齒鑷、持針器、彎鉗、1/10 000精度天平、直鉗、剃毛機(jī)等均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理研究室提供；1 mL注射器、針、線、23號刀片、醫(yī)用紗布、棉球均購自江蘇省中醫(yī)院。

1.4 樣品制備

分別取中藥材于江蘇省中醫(yī)院代煎，將煎好的中藥按成人臨床用藥量的20倍換算為高濃度、10倍換算為中濃度、5倍換算為低濃度，在南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室濃縮，中藥高濃度濃縮至5.4 g(生藥)·mL-1，中藥中濃度將高濃度用純水等倍稀釋至2.7 g(生藥)·mL-1，中藥低濃度將中濃度用純水等倍稀釋至1.35 g(生藥)·mL-1；用研缽將頸復(fù)康磨細(xì)之后，用純水配制成0.17 g·mL-1； 用天平稱取10 g水合氯醛，用100 mL純水配制成10 %水合氯醛備用。

1.5 大鼠脊髓壓迫模型

參考徐遠(yuǎn)坤等[1]的方法：隨機(jī)選取10只大鼠為假手術(shù)組(只暴露頸椎椎板，不咬除椎板，不造成大鼠脊髓壓迫模型)。其余50只均在10 %水合氯醛(0.4 mL·Kg-1)麻醉下，用剃毛機(jī)剃除大鼠頸后的毛，常規(guī)碘伏消毒、鋪巾，取大鼠頸椎后正中切口長3～4 cm切開皮膚、皮下，暴露頸肩部肌群，找到第七頸椎棘突(所有頸椎棘突均可用手觸及，最高突起處即是)，自下往上正中切開肌肉群向兩側(cè)牽開，沿棘突兩側(cè)以23號刀片剝離棘突上附著肌肉，即可暴露整個頸椎骨面；自第七頸椎棘突基底部離斷第七頸椎棘突并取出，刮除骨面附著組織備用；自第七頸椎棘突往上找到第5或6頸椎椎板，咬除部分椎板，并取相應(yīng)直徑的第七頸椎棘突骨塊植入椎間隙，以不出現(xiàn)松動為度，并盡量向椎管內(nèi)嵌壓，以出現(xiàn)上肢肌肉反射性抽搐為度，縫合肌肉、皮膚，肌肉注射青霉素8萬U/只，術(shù)畢。青霉素連續(xù)肌注3 d，術(shù)前及術(shù)后均不必禁食。為了避免大鼠相互擠壓造成的傷害甚至死亡，術(shù)后采取單籠喂養(yǎng)并任其自由活動。造模過程中由于麻醉劑量控制不精準(zhǔn)導(dǎo)致大鼠死亡7只，3只可能是因?yàn)槭中g(shù)創(chuàng)傷太大從而導(dǎo)致全身衰竭而亡。

1.6 分組及給藥

為保證大鼠受損脊髓由急性壓迫轉(zhuǎn)為慢性壓迫，術(shù)后適應(yīng)性觀察2周，待大鼠傷口基本愈合后采取合籠喂養(yǎng)。為保證脊髓損傷輕與重的大鼠在每組中的數(shù)量相當(dāng)，術(shù)后1d根據(jù)改進(jìn)Rivaling的斜板實(shí)驗(yàn)的平均度數(shù)、Tarlov評分、BBB評分將其分為益氣活血方高濃度組(54g·kg-1·d-1)、益氣活血方中濃度組(27g·kg-1·d-1)、益氣活血方低濃度組(13.5g·kg-1·d-1)組 、頸復(fù)康組(1.7g·kg-1)、NS組，益氣活血方高、中、低濃度組以及頸復(fù)康組采用1 mL·100 g-1灌胃給藥，NS組及假手術(shù)組灌服等量NS，每日給藥1次，連續(xù)4周。

1.7 取材

取出受損組織后放進(jìn)液氮中，后轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱中保存，用時取出用于檢測SOD、MDA的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

不同濃度的益氣活血方及頸復(fù)康顆粒均能顯著增加大鼠受損脊髓組織內(nèi)SOD的含量，與NS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高濃度、中濃度及頸復(fù)康顆粒均能顯著降低MDA含量，與NS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.05，P<0.01)；中藥低濃度雖亦能降低MDA含量，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中SOD、MDA含量

注：與NS組比較,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

3 討 論

研究表明，脊髓受壓后缺血與缺氧導(dǎo)致某些內(nèi)源性物質(zhì)的激活,局部自由基蓄積, 使脊髓血管痙攣、閉塞,血流量進(jìn)一步減少,水腫加劇,從而引起脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能損傷甚至變性壞死。在脊髓受壓繼發(fā)性損害的過程中,機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化,形成MDA等脂質(zhì)過氧化物。SOD能夠直接清除氧自由基，避免活性氧的傷害。故組織中SOD含量的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[2]。二者聯(lián)合測定能間接反映氧自由基的含量及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)度[3]。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶,通過自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,再由過氧化氫酶和谷胱苷肽過氧化氫酶變?yōu)樗?是清除自由基的機(jī)制之一[4]。藥理實(shí)驗(yàn)顯示黃芪提取物(黃芪甲苷)具有非常好的抗氧化作用[5]，在體內(nèi)缺血再灌注損傷[6]模型中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)黃芪甲苷灌胃后的動物體內(nèi)SOD等抗氧化酶的含量增加，Bcl-2基因表達(dá)增加，而Bax基因表達(dá)下降，能明顯抑制超氧離子的產(chǎn)生，減輕由超氧離子引起的細(xì)胞微結(jié)構(gòu)損傷及組織損傷和壞死。當(dāng)歸在保護(hù)損傷神經(jīng)及促進(jìn)神經(jīng)再生方面具有重要作用[7]，同時，它還具有抗輻射、抗氧化、抗衰老的作用[8]。丹參提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,可作為一種新的自由基清除劑和天然抗氧化劑[9]，通過對超陰離子的清除作用來阻止生物膜的脂質(zhì)過氧化,從而保護(hù)生物膜[10]。黃芪、丹參、當(dāng)歸等能直接擴(kuò)張周圍血管，明顯改善微循環(huán)[11]；并能減輕神經(jīng)水腫、炎癥、出血、變性和脫髓鞘，從而促進(jìn)神經(jīng)組織的再生[12]。方中諸藥合用，有明顯增強(qiáng)氧自由基清除率以及改善CSM術(shù)后脊髓功能狀態(tài)的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠自體第七頸椎棘突椎間移植法制造脊髓壓迫模型來觀察不同濃度的益氣活血方對受損脊髓內(nèi)SOD和MDA含量的影響，結(jié)果顯示益氣活血方具有提高氧自由基清除率的功能。其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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Effects of the PNQAB on the contents of SOD and MDA in damaged rats' spinal cord tissue of the chronic Spinal Oppression Model

YangYu1,XiaJianlong1*,ChenGang2,YangTing1,CaiPing2.

1.TheFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023,Jiangshu,China. 2.JiangsuProvinceHospitalofTCM,Nanjing210046,Jiangshu,China.

Objective To observe the effects exerted on the contents of SOD and MDA in damaged rats' spinal cord tissue, exposed to Jinfukang and different concentrations of the PNQAB (the prescription for nourishing qi and activating blood), were surveyed and discussed in the chronic spinal oppression model.Methods 10 SD-Rats were used as the sham-operated group in this experiment selected randomly from the sixty subjects, fed with the normal saline within explosion of the vertebral lamina and free from oppression of the spinal cord. The remaining were applied to establish the rat's spinal oppression model by grafting the self 7th cervical vertebrae spinous process at the part of C4-5 or C5-6 intervertebral space, then divided into three groups based on the assessment results of the spinal cord function at the 1st day postoperatively, feeding with the PNQAB under different concentrations (Group A)，Jinfukang (Group B) and Normal saline (Group C), respectively. After were treated 4 weeks, all the rats were narcotized to get the specific spinal cord for the determinations of SOD and MDA.Results The results were shown that the PNQAB regardless of the concentration difference and Jingfukang particles can both increase the content of SOD in rats' damaged spinal cord tissues significantly (P<0.05), while the PNQAB under high/medium concentrations and Jingfukang particles can also notably decrease MDA content, but not for the PNQAB in low concentration.Conclusion The PNQAB can effectively enhances the scavenging rate of the reactive oxygen radicals in tissues of the damaged spinal cord, and promotes the recovery of the spinal cord function.

PNQAB； Rat； CSM； SOD； MDA

R-332

A

1000-744X(2016)08-0814-03

2015-11-02)

△通信作者， E-mail: drjlxia@aliyun.com