谷子顯性恢復(fù)基因的AFLP分析

1，程校云2，姚志剛1，龔學(xué)臣1，王凌云1

（1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2. 河北省懷來縣農(nóng)業(yè)局，河北 懷來 075131）

摘要：赤峰顯性核不育谷子是在谷子中首次發(fā)現(xiàn)的核不育材料，該材料的育性受2對核顯性基因互作控制，一對是顯性核不育基因Msch，另一對是顯性上位育性恢復(fù)基因Rf。兩者共同存在時顯性上位育性恢復(fù)基因Rf能抑制顯性核不育基因Msch的表達，從而表現(xiàn)可育。利用已構(gòu)建的不育基因Msch的上位育性恢復(fù)基因Rf的近等基因系（NILs）為材料，通過對300對AFLP引物組合進行篩選，找到了與顯性上位育性恢復(fù)基因Rf緊密連鎖的2個AFLP標(biāo)記（E15/M52和E20/M41），與不育基因的遺傳距離分別是7.0 cM和12.7 cM，而且位于不育基因的同一側(cè)，標(biāo)記間相距5.7 cM。

關(guān)鍵詞：谷子（Setaria italica）；顯性上位育性恢復(fù)基因；AFLP標(biāo)記

中圖分類號：S515；Q789 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1547-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.003

AFLP Analyses of the Dominant Restoring Gene in Foxtail Millet （Setaria italica）

YUAN Jin-cheng1，CHENG Xiao-yun2，YAO Zhi-gang1，GONG Xue-chen1，WANG Lin-yun1

（1. Hebei North University， Zhangjiakou 075000， Hebei， China； 2. Agricultural Bureau of Huailai County， Huailai 075131， Hebei， China）

Abstract： “Chifeng sterility”， a nuclear genic interaction type of dominant male sterility， was the first dominant genic male sterile mutant identified in foxtail millet （Setaria italica（L.） Beauv.）. The fertility of “Chifeng sterility” can be restored by introduction of a dominant epistatic fertility restoring gene in some millet varieties. One was the dominant male sterile gene Msch， and the other one was the dominant epistatic fertility restoring gene Rf. When the two genes existed at the same time， the gene Rf could control the performance of gene Msch to show fertility. To identify AFLP markers linked with the gene Rf conferring the fertility restoring， no restoring bulk （BH） and restoring bulk （H） produced from the NILs were used to screen AFLP polymorphism. A total of 300 random AFLP primer combinations were polymorphic. Two markers （E15/M52 and E20/M41 were found tightly linked with the dominant epistatic fertility restoring gene with 7.0 cM and 12.7 cM，respectively. The markers were in the same side of the male sterile gene with 5.7cM.

Key words： foxtail millet（Setaria italica）； dominant epistatic fertility restoring gene； AFLP marker

雄性不育性在植物界普遍存在，迄今為止，已經(jīng)在600多個物種及種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育，其中包括玉米、水稻、大麥、谷子、高粱、油菜、棉花等主要農(nóng)作物[1]。細(xì)胞核雄性不育（Nuclear male sterility）是由核基因控制的自然界最常見的雄性不育現(xiàn)象，人們已經(jīng)在玉米、棉花、谷子、水稻、大豆、小麥、油菜和大白菜等許多作物上發(fā)現(xiàn)和誘導(dǎo)出這種雄性不育類型。在核不育材料中多數(shù)是由隱性基因控制的，由顯性基因控制的核不育現(xiàn)象較少，國內(nèi)外曾在棉花、萵苣、紅胡麻草、馬鈴薯、小麥、亞麻等少數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)過[2-4]。谷子（Setaria italica）核基因互作型雄性不育是胡洪凱等[5，6]1978年首次從澳大利亞谷×吐魯番谷雜交后代中發(fā)現(xiàn)的，研究證實該材料的不育性受1對核顯性基因控制，并定名為赤峰顯性核不育，將該不育基因命名為Msch。進一步的研究表明，這份顯性雄性不育材料具有其特殊性，表現(xiàn)在：①它的雜合不育株和純合不育株的花藥內(nèi)有部分正?？捎ǚ郏诒狈焦茸赢a(chǎn)區(qū)花藥始終不開裂不散粉，自交不結(jié)實；但在特定短日照的生態(tài)條件下（如冬季在低緯度的海南三亞、通什和廣東湛江等地）則花藥部分開裂，能產(chǎn)生6.0%～10.0%的自交種子，可以獲得純合的全不育群體[7]；②經(jīng)過大量的測配，從它的姊妹系中發(fā)現(xiàn)了恢復(fù)源材料181-5，181-5攜帶的顯性育性恢復(fù)基因Rf可以抑制雜交種中顯性不育基因的表達，使育性恢復(fù)正常[5]?；谶@些特點，有學(xué)者建立起一套特殊的“三系”制種體系，巧妙地解決了雜種優(yōu)勢利用中不育系繁種、育性恢復(fù)等問題，為作物雜種優(yōu)勢的利用開辟了一條新路，也進一步豐富了雜種優(yōu)勢利用的理論基礎(chǔ)[8]。

為了更有效地利用這種雙顯性基因控制的不育性來配制谷子雜交種，作者找到了2個與不育基因Msch緊密連鎖的AFLP標(biāo)記P17/M37和P35/M52，其與不育基因Msch的遺傳距離分別為2.1 cM和1.4 cM，是分布于不育基因同一側(cè)的AFLP標(biāo)記，這2個標(biāo)記間的遺傳距離為0.7 cM[9]。本試驗在此基礎(chǔ)上利用AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）技術(shù)，通過1對近等基因系，尋找與抑制谷子核不育基因Msch表達的顯性育性恢復(fù)基因Rf緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以快速、準(zhǔn)確、有效地鑒定雜種后代的基因型，指導(dǎo)雜種優(yōu)勢利用于育種實踐，將優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到更多的不同遺傳背景的育種材料中，同時也可以為雄性不育基因的克隆，不同作物雄性不育特性的比較基因組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

用于研究的材料有近等基因系msmsrfrf和msmsRfRf（圖1）及F2的3∶1（Rf∶rfrf）群體（圖2）。研究材料種植在試驗田和溫室，苗期（7葉）隨機選取近等基因系各5株和3∶1群體300株，以單株為單位分別編號掛牌，然后按編號取單株嫩葉提取基因組總DNA。開花前各單株分別與同期播種基因型為MsMsrfrf的純合不育系株穗套在一個袋內(nèi)作測交，海南種植雜種后代的種子，通過育性來判斷各單株是否含有顯性基因Rf。

1.2 顯性育性恢復(fù)基因Rf的表型鑒定

由雜合不育株Msmsrfrf與恢復(fù)系181-5（msmsRfRf）雜交獲得F1，F(xiàn)1自交選其不育株再用恢復(fù)系181-5回交，后代再自交。這樣連續(xù)回交5代，最后獲得了恢復(fù)系181-5（msmsRfRf）的近等基因系msmsrfrf（圖1）。

近等基因系苗期各取5株用于DNA的提取，把含有Rf恢復(fù)基因的5個單株基因組DNA等量混合構(gòu)成恢復(fù)池，把不含恢復(fù)基因的5個單株基因組DNA等量混合構(gòu)成不恢池。3∶1群體是由雜合不育系（Mschmsrfrf）與恢復(fù)系181-5（msmsRfRf）雜交獲得的F2群體（圖2），該F2群體2008年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)試驗田種植，抽穗期隨機選取300個F2單株穗與純合不育系（MschMschrfrf）的株穗套在一個袋內(nèi)作測交，同時取這300個F2單株的葉片用于DNA提取。收獲期，套在一個袋里的2個單株若都結(jié)種，收獲不育株上的測交種，在海南種植，每穗一行，根據(jù)穗行的育性分離情況來確定F2單株是否含有Rf基因。測交后代在海南全可育或育性有分離的株行對應(yīng)的F2單株是含有顯性上位基因Rf，而測交后代全不育的株行對應(yīng)的F2單株和套在一個袋里的2個不結(jié)實穗的F2單株是基因rf（圖2）。參照Saghai-Maroof等[10]的CTAB法抽提并純化DNA。

1.3 AFLP分析

AFLP分析程序參照Zabeau和Vos發(fā)明的方法。AFLP酶切采用EcoRⅠ和MseⅠ雙酶切組合。內(nèi)切酶和T4連接酶購自NEB（New England Biolab）公司，接頭、引物及其他試劑購自上海博亞生物技術(shù)公司，Taq DNA聚合酶購自Promega公司。選擴采用E+2/M+3和E+3/M+3引物組合。擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色觀察。首先對近等基因系進行分子檢測，尋找多態(tài)性，對于在1對近等基因系之間有多態(tài)性的引物組合，進一步用3∶1群體檢測其與目標(biāo)性狀的連鎖遺傳關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果記錄有帶計為1，無帶計為0。數(shù)據(jù)處理用Mapmaker EXP Version 3.0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯性恢復(fù)基因Rf的鑒定

2008年冬天在海南種植測交種，每穗一行，收獲期觀察育性。如果穗行出現(xiàn)育性分離或全可育，表明這個穗行的父本含有抑制不育基因Msch表達的顯性恢復(fù)基因Rf，若穗行全不育表明其父本不含有顯性恢復(fù)基因Rf（圖2）。從圖2不難看出Rf∶rfrf的理論比率為3∶1。本試驗在試驗田里隨機選取300個單株穗與純合不育系（MschMschrfrf）的株穗套在一個袋內(nèi)作測交，共收獲了241株測交種，不育株是59株。在海南種植的241個株行中，全可育和育性分離的株行有222行，全不育的有19行，含顯性不育恢復(fù)基因的植株與不含有恢復(fù)基因的植株的比率為222∶78（19+59），符合3∶1的規(guī)律。

2.2 與不育基因Msch的恢復(fù)基因Rf連鎖的AFLP標(biāo)記

用近等基因系（msmsRfRf、msmsrfrf）DNA池對300對引物組合進行篩選，發(fā)現(xiàn)每個引物組合均可擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶，每對引物約能擴出清晰的50條帶，擴增片段長度50～1 000 bp。其中，有36對引物組合的擴增產(chǎn)物在近等基因系間表現(xiàn)出多態(tài)性，用3∶1群體的部分單株對以上引物組合進一步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有E15/M52和E20/M41與恢復(fù)基因Rf緊密連鎖，且分別擴出240 bp和220 bp的片段（圖3、圖4）。對于連鎖較緊密的標(biāo)記E15/M52和E20/M41，用168株3∶1群體進行單株P(guān)CR檢測。將分子標(biāo)記和田間表型的統(tǒng)計數(shù)據(jù)利用Mapmaker 3.0軟件進行計算與分析，結(jié)果表明標(biāo)記E15/M52和E20/M41與Rf基因的遺傳距離分別為7.0 cM和12.7 cM，分布于Rf基因的同一側(cè)，這2個標(biāo)記間的遺傳距離為5.7 cM（圖5）。

3 討論

雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，是實現(xiàn)谷子雜種優(yōu)勢利用最經(jīng)濟、有效的途徑之一[7，11-13]。谷子核基因互作型雄性不育的不育性受兩對顯性核基因（不育基因Msch和上位育性恢復(fù)基因Rf）互作控制[5，6]，恢復(fù)基因通過顯性上位作用來抑制不育基因的表達從而恢復(fù)育性，起到恢復(fù)基因的作用。這種由雙顯性基因互作控制的雄性核不育材料的發(fā)現(xiàn)為谷子雜種優(yōu)勢利用提供了一條全新的途經(jīng)[8]，但同時也應(yīng)注意到由于谷子中的雙顯性基因控制的雄性不育性有它自己的特點，若將不育基因轉(zhuǎn)移到不同的優(yōu)良遺傳背景中以及進行必要的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)育工作十分艱難與緩慢。以前作者找到的2個與不育基因緊密連鎖、分布于不育基因同一側(cè)的AFLP標(biāo)記，與目標(biāo)基因之間的距離比較近（2.1 cM 和1.4 cM）[9]，可快速鑒定轉(zhuǎn)育后代，加速不育系的選育進程，有助于谷子顯性核不育材料在育種中得到更加快捷、有效、廣泛的應(yīng)用。本研究在此基礎(chǔ)上找到了2個與控制不育基因Msch的上位恢復(fù)基因Rf連鎖、分布于上位恢復(fù)基因Rf的同一側(cè)的AFLP標(biāo)記，與目標(biāo)基因之間的距離分別是7.0 cM 和12.7 cM，盡管距離比較遠(yuǎn)，但在輔助雜種配置方面可以得到廣泛的應(yīng)用。利用此標(biāo)記，可更加有效地把顯性上位育性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)移到遺傳基礎(chǔ)優(yōu)良的品系中，培育新的優(yōu)良恢復(fù)系，還可以以它為橋梁通過連續(xù)回交和聚合雜交的方式，聚合有利基因，創(chuàng)制新的優(yōu)良谷子新品系，進一步豐富谷子的種質(zhì)資源。

眾所周知，對于由2對顯性基因控制的雄性不育的機制，有2種假說；一是核基因互作假說，一是復(fù)等位基因假說。核基因互作假說[14]認(rèn)為，不育性由2對核基因控制，顯性核不育基因Ms對隱性可育基因ms為完全顯性，顯性抑制基因Rf對非抑制基因rf為完全顯性，不育株有MsMsrfrf和Msmsrfrf 2種基因型，可育株有7種基因型（MsMsRfRf、MsMsRfrf、MsmsRfRf、MsmsRfrf、msmsRfRf、msmsRfrf和msmsrfrf）。復(fù)等位基因假說[15]認(rèn)為，在控制育性的位點上有Msf、Ms和ms3個復(fù)等位基因，Msf為顯性恢復(fù)基因，Ms為顯性不育基因，ms為隱性可育基因，三者之間的顯隱性關(guān)系為Msf>Ms>ms。

不育株有2種基因型MsMs和Msms，可育株有4種基因型MsfMsf、MsfMs、Msfms和msms。

通過遺傳學(xué)的分離比例來確定是否是顯性上位互作或是復(fù)等位基因[5]，赤峰顯性核不育谷子在遺傳學(xué)上已被證明了是顯性上位互作來控制的雄性不育性[6]。為了提供更加有利、可靠的分子證據(jù)，利用谷子AFLP圖譜，將不育基因Ms和上位恢復(fù)基因Rf定位于染色體上，看它們是被定為在同一位點上還是不同位點，從而來判斷它們是上位互作基因還是復(fù)等位基因。同時，克隆這些基因，進一步去闡明谷子雙顯性基因控制的不育性的遺傳機制。

赤峰顯性核不育谷子的這種雙顯性基因控制的雄性不育性與萍鄉(xiāng)顯性核不育水稻的育性控制有許多相似之處[6]，可以把這2種機制合并研究，來確定植物之間這種控制育性的相同機理；也可以通過比較谷子、水稻與其他植物上雙顯性基因控制的不育性的遺傳機制的異同點，來確定不同植物之間的不同發(fā)育特性，從而進一步完善雙顯性基因控制的不育性的遺傳機制的理論基礎(chǔ)，將會更有利于雜種優(yōu)勢的利用。

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