氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定楊桃中的內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑

摘要：建立了楊桃中內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑同時測定的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）分析方法。楊桃樣品用乙腈勻漿提取、鹽析、石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱凈化，乙腈/甲苯（3∶1，V/V）洗脫，濃縮定容，最后通過GC-MS/MS進(jìn)行分析。農(nóng)藥的添加水平為0.02～0.50 mg/kg時，3種農(nóng)藥的回收率為75.6%～99.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～10.4%；內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑3種農(nóng)藥的定量限分別為0.010、0.020、0.005 mg/kg。該方法能滿足楊桃中內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑3種農(nóng)藥多殘留檢測的要求。

關(guān)鍵詞：楊桃；農(nóng)藥殘留；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號：O657.63；S482.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1717-05

內(nèi)吸磷用于防治蔬菜果樹的蚜蟲、紅蜘蛛、線蟲等效果良好，但內(nèi)吸磷屬高毒、高殘留的有機磷農(nóng)藥，在中國禁止在蔬菜和果樹結(jié)果期使用，針對可以使用的果蔬種類，國家也規(guī)定其最高殘留限量。抑霉唑是一種內(nèi)吸性殺菌劑，不僅可有效防治果蔬中的許多真菌病害，還對果蔬防腐有特效。腈菌唑?qū)賰?nèi)吸性三唑類殺菌劑，是甾醇脫甲基化抑制劑，常用于防治水果葉斑病、白粉病、黑星病等。

楊桃主要分布于中國南部的福建、廣東、海南、臺灣等地，這些地區(qū)氣候溫暖，病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，故楊桃上使用的農(nóng)藥種類及頻率較高，直接導(dǎo)致食品安全隱患。農(nóng)藥殘留對食品安全帶來的影響越來越明顯，對食品農(nóng)藥殘留的檢測方法的要求也越來越高。

當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者對內(nèi)吸磷、抑霉唑、腈菌唑的定性、定量檢測方法已有較多的探索。目前關(guān)于內(nèi)吸磷[1-5]、抑霉唑[5-10]和腈菌唑[11-15]的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）、液相色譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）。近年來，雖然氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測楊桃中有機磷農(nóng)藥的報道較多[16-18]，但是利用GC-MS/MS檢測楊桃中多種農(nóng)藥殘留的相關(guān)報道很少。相比于GC、GC-MS的檢測方法，GC-MS/MS檢測技術(shù)通過多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）選擇特征母離子和子離子形成定量、定性離子對，不僅有效的減少了基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，同時定性的準(zhǔn)確度和檢測的靈敏度也都得到了提升，適用于食品安全領(lǐng)域。

本研究建立了一種利用GC-MS/MS技術(shù)對楊桃中內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑同時進(jìn)行定性與定量檢測的確證方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 乙腈、正己烷（HPLC級，美國Fisher公司）；毛細(xì)管氣相色譜柱SLB-5ms（美國SUPELCO公司）；甲苯、氯化鈉（分析純，廣州試劑公司）。

1.1.2 儀器和耗材 7000型三重串聯(lián)四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；T25 basic型高速勻漿機（廣州儀科實驗技術(shù)有限公司）；RE52 CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；EB-280-12型電子頂載天平（日本島津公司）；QL-901型旋渦混合器（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠）；石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱（Carbon/NH2，500 mg/6 mL，Agilent Technologies）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)內(nèi)吸磷、抑霉唑、腈菌唑，純度≥99%（農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心）。供試材料為楊桃（Averrhoa carambola L.），采自海南。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 氣相色譜條件： 毛細(xì)管氣相色譜柱SLB-5 ms（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；程序升溫初始溫度150 ℃，以10 ℃/min升溫至200 ℃，以3 ℃/min升溫至236 ℃，最后以30 ℃/min升溫至280 ℃；總運行時間為18.5 min；載氣，氦氣（純度≥99.999%）；恒流模式，流速為1.00 mL/min；進(jìn)樣口溫度為260 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件： 碰撞氣流速為2.25 mL/min；離子源，電子轟擊源為70 eV；掃描方式，正離子掃描；離子源溫度為230 ℃；溶劑延遲為4.00 min；多反應(yīng)監(jiān)測，3種農(nóng)藥在串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件下的保留時間、定量離子對、定性離子對以及碰撞能量見表1。

1.2.2 樣品處理 稱取樣品25.00 g（精確至0.01 g）于150 mL燒杯中，加入50.0 mL乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集全部濾液，蓋上塞子，劇烈震蕩2 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分離。準(zhǔn)確吸取10.00 mL上層乙腈提取液于50 mL 圓底燒瓶中，在40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL 乙腈/甲苯（3∶1，V/V）溶解殘渣，漩渦混勻，待凈化。固相萃取柱中加5 mL 乙腈/甲苯（3∶1，V/V）預(yù)洗柱，當(dāng)液面接近柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化溶液，用100 mL圓底燒瓶收集洗脫液，用2 mL 乙腈/甲苯（3∶1，V/V）洗圓底燒瓶后過柱，并重復(fù)兩次；最后用20 mL乙腈/甲苯（3∶1，V/V）洗脫，合并于100 mL圓底燒瓶，將圓底燒瓶40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣吹干后，最后用正己烷定容至5 mL，在混合器上混勻后，若殘留量較低時，可以定容至2 mL，待GC-MS/MS測定。

1.2.3 添加回收率與精密度測定 稱取4組經(jīng)測定不含上述3種農(nóng)藥殘留的楊桃空白樣品，每組5個重復(fù)，在空白樣品中分別添加濃度水平為0.02、0.05、0.10、0.50 mg/kg，按照上述提取和色譜操作條件進(jìn)行分析，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理凈化條件優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇 內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑均微溶于水，溶于一般有機溶劑如乙腈、丙酮、正己烷等。對于提取劑的選擇，本試驗采用回收試驗法比較了常用分析農(nóng)藥殘留的提取劑（乙腈、丙酮和正己烷），結(jié)果表明，使用丙酮為提取劑時，丙酮與水互溶導(dǎo)致水相和有機相分層不明顯，從而造成回收率較低；使用正己烷作為提取劑時，雖然正己烷與水不互溶，但是提取效率仍沒有乙腈高；選用乙腈為提取劑，樣品回收率滿足農(nóng)藥殘留檢測方法的要求，故選用乙腈為提取劑。

2.1.2 固相萃取柱的優(yōu)化 氨基柱（NH2）是鍵合相為氨丙基的硅膠基質(zhì)小柱，同時具有氫鍵和陰離子交換的性質(zhì)，能促進(jìn)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的分離，并且有效地去除脂肪酸、有機酸和糖等雜質(zhì)；石墨化碳黑柱（Carbon）填充了高純的石墨化碳顆粒，其表面的正六元環(huán)結(jié)構(gòu)使其對平面分子有極強的親和力，適用于絕大部分農(nóng)藥的萃取和凈化；石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱（Carbon/NH2）集中了石墨化碳黑和氨基兩種填料的優(yōu)勢，可以有效去除食品中的色素、甾醇、脂肪酸、有機酸和糖類等雜質(zhì)，適合于不同極性農(nóng)藥的多殘留檢測。比較了農(nóng)殘檢測中常用的固相萃取柱（NH2柱、Carbon柱、Carbon/NH2混合型柱）的凈化和回收效果，結(jié)果表明，Carbon/NH2混合型柱凈化后，洗脫比較干凈，去除干擾的效果最好，可獲得較理想的回收率。WATANABE等[19]利用Carbon/NH2混合型柱凈化農(nóng)產(chǎn)品中的7種新煙堿類殺蟲劑。陳紅平等[20]同樣采用Carbon/NH2混合型柱凈化處理樣品建立了氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定茶葉中72種農(nóng)藥殘留量的方法。本試驗檢測的楊桃樣品含糖量在10%以上，同時其有機酸含量也較高，利用Carbon/NH2混合型柱可以有效去除糖類等雜質(zhì)，因此本方法最終依據(jù)結(jié)果選擇Carbon/NH2混合型柱為凈化柱。

2.2 待測農(nóng)藥定量和定性離子的選擇

首先，分別將3種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1.0 mg/L）在m/z 0～500之間進(jìn)行全掃描分析（Full Scan），確定每種農(nóng)藥的保留時間（表1）和質(zhì)譜圖（圖1）。從質(zhì)譜圖中找出各組分的一級碎片離子作為母離子，母離子的選擇主要考慮5個方面因素：特征性高、質(zhì)量數(shù)高、對稱性高、重現(xiàn)性好且不同于柱流失碎片離子。綜合考慮，選擇適宜的離子初步定為母離子。其次，選擇子離子，應(yīng)用離子轟擊掃描對母離子在不同碰撞能量下進(jìn)行電離轟擊，確定二級質(zhì)譜圖，選擇強度較大、靈敏度高的為子離子。對每一組離子對分別選擇碰撞能量為5、10、15、20、25、30、35、40 eV進(jìn)行掃描，以響應(yīng)強度大小為依據(jù)對碰撞能量進(jìn)行選擇，再在此基礎(chǔ)上對選擇的碰撞能量進(jìn)行微調(diào)，對碰撞電壓進(jìn)一步優(yōu)化，使得最終監(jiān)測的子離子產(chǎn)生最強響應(yīng)。選擇豐度最高的一對子離子進(jìn)行定量分析，選擇豐度次高的一對子離子進(jìn)行定性分析，表1給出了優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測條件。圖2是3種農(nóng)藥（0.20 mg/L）在表1條件下得到的多反應(yīng)監(jiān)測總離子流圖，從圖2中可以看出所有譜峰峰形尖銳、對稱性好、各譜峰間完全分離。

2.3 線性方程、定量限、回收率和精密度

2.3.1 線性方程 將一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2”所述分析條件進(jìn)行測定，以內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系曲線，對測定結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)分析。結(jié)果表明，在0.02～0.50 mg/kg內(nèi)線性關(guān)系良好（表2）。

2.3.2 定量限 定量限是指可以進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量測定的最低水平。不同水平下得到的準(zhǔn)確度應(yīng)滿足以下要求：添加水平在0.001～0.010 mg/kg時，回收率為60%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤30%；添加水平在0.01～0.10 mg/kg時，回收率范圍為70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤20%；添加水平在0.1～1.0 mg/kg時，回收率應(yīng)在70%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤15%。添加標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度得到的信噪比一般為10。根據(jù)3倍信噪比（S/N）計算楊桃中3種農(nóng)藥的檢出限（LOD）為0.000 9～0.006 0 mg/kg，根據(jù)10倍信噪比確定的定量限（LOQ）為0.003～0.020 mg/kg，為配合實際樣品和定量準(zhǔn)確，本試驗從添加水平0.003～0.020 mg/kg，通過添加回收率試驗和準(zhǔn)確定量的要求，因此，楊桃中內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑的定量限通過實際添加回收試驗最終確定為0.010、0.020、0.005 mg/kg，詳見表3。

2.3.3 回收率和精密度 方法的準(zhǔn)確度是指所得結(jié)果與真值的符合程度，農(nóng)藥殘留檢測方法的準(zhǔn)確度一般用回收率進(jìn)行評價。重復(fù)性一般做3個水平試驗，每個水平重復(fù)次數(shù)不少于5次。本試驗選擇4個水平試驗對方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行驗證，在4組各5個空白樣品中分別添加濃度水平為0.02、0.05、0.10、0.50 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述提取和色譜操作條件進(jìn)行測定，計算回收率和精密度。結(jié)果表明，3種農(nóng)藥殘留的平均回收率為75.6%～99.0%；5次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～10.4%，均滿足定量分析要求，結(jié)果見表4。

3 小結(jié)與討論

本試驗建立了楊桃中內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑的GC-MS/MS分析檢測方法。楊桃樣品經(jīng)乙腈勻漿提取，石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱凈化，GC-MS/MS檢測。在0.02～0.50 mg/kg下進(jìn)行添加回收試驗，3種農(nóng)藥的平均回收率為75.6%～99.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～10.4%（n=5）；方法的線性范圍為0.02～0.50 mg/L，相關(guān)系數(shù)大于0.99；內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑的定量限分別為0.010、0.020、0.005 mg/kg。該方法簡單、靈敏度和準(zhǔn)確度高，可實現(xiàn)楊桃中內(nèi)吸磷、抑霉唑和腈菌唑殘留的定性與定量檢測。

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