釀酒酵母的紫外誘變選育及發(fā)酵條件研究

摘要：以果園土為菌種來源，采用平板分離法得到5種酵母菌，對(duì)其進(jìn)行紫外線誘變，篩選出7株酵母菌突變株，通過測(cè)定突變株的發(fā)酵性能，從中篩選出1株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及發(fā)酵力均較好的酵母突變株N4-4，其發(fā)酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對(duì)照菌株分別提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%，通過單因素和正交試驗(yàn)確定該突變株的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在30 ℃、120 r/min的培養(yǎng)條件下，突變株最佳發(fā)酵條件為3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接種量（V∶V）。

關(guān)鍵詞：酵母菌；紫外線誘變；發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)：TS261.1；Q93.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1664-04

酵母菌是白酒發(fā)酵過程中的一種重要微生物，白酒風(fēng)味的形成與發(fā)酵過程中各種酵母菌息息相關(guān)[1]。酵母菌的主要作用是將原料糖化后的絕大部分糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，同時(shí)生成甘油、高級(jí)醇、酯、醛等代謝產(chǎn)物，直接影響著白酒的色澤、香氣及口感，決定著白酒的質(zhì)量。酵母菌的發(fā)酵特性常常因菌株的不同而存在明顯的差異[2]，野生型酵母菌在工業(yè)發(fā)酵過程中不可避免地受到脅迫條件（如乙醇毒性、高溫脅迫等）的影響，最終影響到乙醇產(chǎn)率和白酒品質(zhì)以及其經(jīng)濟(jì)效益。工業(yè)上常常采用紫外線誘變的方法，對(duì)釀酒酵母工業(yè)菌株進(jìn)行改良來提高菌株對(duì)脅迫條件的耐受性[3]。本試驗(yàn)采用紫外線誘變的方法對(duì)果園土中分離到的5株酵母菌進(jìn)行誘變，以期篩選出發(fā)酵力較高的突變株，為提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種來源：分離自陜西省周至縣邵家堡村蘋果園土壤中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌分離、純化和菌種保藏 酵母菌的分離、純化和菌種保藏參考文獻(xiàn)[4-6]。

1.2.2 不同菌株發(fā)酵性能測(cè)定 將分離得到的菌株分別制成酒曲后用常壓干燥法測(cè)定水分含量；采用酸堿滴定法測(cè)定酸度；采用碘量法測(cè)定液化酶活力；采用DNS法測(cè)定糖化酶活力；采用福林-酚法測(cè)定蛋白酶活力；采用CO2失重法測(cè)定發(fā)酵力[7，8]。

1.2.3 紫外線（UV）誘變 選取發(fā)酵性能最好的菌種接種至裝有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，130 r/min振蕩培養(yǎng)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的釀酒酵母菌懸液[9]。再用麥芽汁液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋，使菌種的濃度達(dá)到1×106 個(gè)/mL。打開紫外燈（15 W），預(yù)照射20 min，使其功率達(dá)到穩(wěn)定。取4 mL菌懸液放入直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿平放在距紫外燈30 cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上，啟動(dòng)磁力攪拌器，照射0、1、2、3、4、5、6 min后將菌液在黑暗中冷凍保存1～2 h，然后在紅燈下稀釋至1×10-6個(gè)/mL，并涂布平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌株致死率，保存致死率在75%以上的孤立菌落[10]。

1.2.4 優(yōu)良突變株的篩選 在“1.2.3”的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選，篩選方法同“1.2.2”。

1.2.5 優(yōu)良突變株最優(yōu)發(fā)酵條件篩選

1）pH試驗(yàn)：將液體培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至3、4、5、8、9、10，接種1%的優(yōu)良突變株。30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

2）碳源試驗(yàn)：制備含3%的不同碳源（葡萄糖、果糖、麩皮、麥芽糖、甘露糖、乳糖）的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

3）氮源試驗(yàn)：制備含2%的不同氮源[蛋白胨、黃豆粉、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4]的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

4）接種量試驗(yàn)：制備100 mL液體培養(yǎng)基，分別接種2%、4%、6%、8%、10%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

1.2.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇4因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離、純化結(jié)果

經(jīng)反復(fù)分離純化篩選出5種酵母菌，其菌落形態(tài)特征見表2。

2.2 菌株發(fā)酵性能

將所篩選的5種酵母菌分別制成酒曲，測(cè)定其部分理化指標(biāo)，結(jié)果見表3。由表3可知，酒曲N2、N4的水分含量均在12%～13%，酸度在1.1 mmol/100 g以上，研究表明，酸度在0.9～1.3 mmol/100 g的為一級(jí)酒曲，在0.6～0.9 mmol/100 g的為二級(jí)酒曲[6]，因此這兩種酒曲已滿足一級(jí)酒曲的要求。N4號(hào)酒曲液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力均為最高，N2號(hào)酒曲次之。而N2號(hào)酒曲發(fā)酵力最大，N4次之。綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)，選擇N4號(hào)株菌作為出發(fā)菌種進(jìn)行紫外線誘變。

2.3 N4號(hào)菌株的紫外線誘變致死率

由表4可知，紫外線處理對(duì)酵母菌有較強(qiáng)的致死作用。誘變時(shí)間越長(zhǎng)，致死率越高。當(dāng)致死率超過75%時(shí)常引起正突變[10]，因此選擇誘變3 min致死率為97.1%的這4株菌株（記為N4-1、N4-2、N4-3、N4-4），誘變4 min致死率為98.6%的2株菌株（記為N4-5、N4-6）和誘變5 min致死率為99.3%的1個(gè)菌株（記為N4-7）做進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.4 突變株發(fā)酵性能比較

由表5可知，與對(duì)照相比，誘變4、5 min所得的突變株N4-5、N4-6和N4-7發(fā)酵力均有不同程度下降，呈現(xiàn)負(fù)突變。而誘變時(shí)間較短的N4-2、N4-3和N4-4 3株突變株發(fā)酵力較誘變前均有不同程度提高，其中突變株N4-4的發(fā)酵力最好，其液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對(duì)照菌株分別提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%。

2.5 優(yōu)良菌株N4-4的遺傳穩(wěn)定性

根據(jù)突變株發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果，對(duì)優(yōu)良菌株N4-4的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果如表6所示。由表6可知，誘變后得到的優(yōu)良菌株N4-4經(jīng)3代傳遞，菌株發(fā)酵力仍保持較高水平，而且比較穩(wěn)定，說明突變株已具有穩(wěn)定的遺傳性狀。

2.6 優(yōu)良菌株N4-4的最優(yōu)發(fā)酵條件研究

2.6.1 酵母菌發(fā)酵的最適pH 由表7可知，pH對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力影響較大，pH為3～5時(shí)，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；pH為5時(shí)菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最大，分別為2.6×1011 CFU/mL和0.865 g/（g·72 h），然后隨pH再增大，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈下降趨勢(shì)。

2.6.2 酵母菌最適碳源 由表8可知，N4-4酵母菌對(duì)不同糖類物質(zhì)的利用能力差異較大。當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，菌落數(shù)和發(fā)酵力均達(dá)到最大，分別為6.5×1011 CFU/mL、0.913 g/（g·72 h）；當(dāng)碳源為乳糖時(shí)，菌落數(shù)為5.3×107 CFU/mL，發(fā)酵力為0.363 g/（g·72 h），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葡萄糖為碳源時(shí)的菌落數(shù)和發(fā)酵力。

2.6.3 酵母菌最適氮源 由表9可以看出，氮源為 （NH4）2SO4時(shí)，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最佳，分別為2.2×1011 CFU/mL、0.689 g/（g·72 h），因此，選擇（NH4）2SO4為酵母菌培養(yǎng)最適氮源。

2.6.4 酵母菌最適接種量 由表10可以看出，接種量為4%時(shí)，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力均達(dá)到最大，分別為2.2×1011 CFU/mL、0.738 g/（g·72 h），當(dāng)接種量大于4%時(shí)，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力隨接種量的增大而降低。

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表11可知，4個(gè)因素對(duì)酵母菌N4-4發(fā)酵影響的大小次序?yàn)閜H>（NH4）2SO4>葡萄糖>接種量。4個(gè)因素的最佳配比為A2B2C3D1，即葡萄糖3%、pH 5.0、接種量3%、（NH4）2SO4 3%。在此種配比的發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h后，酵母菌N4-4發(fā)酵力可達(dá)0.978 g/（g·72 h）。

3 討論

本研究通過平板分離、紫外線誘變篩選出1株糖化酶活力、液化酶活力、蛋白酶活力旺盛的酵母突變株N4-4，并通過正交試驗(yàn)確定了該突變株的最佳發(fā)酵條件為3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接種量、發(fā)酵溫度30 ℃。本研究雖然對(duì)分離的酵母菌進(jìn)行了選育，使其發(fā)酵性能有了很大程度的提高，但該酵母突變株制作麩曲或大曲后，再次釀造白酒，能否提高白酒產(chǎn)量和品質(zhì)等問題還有待進(jìn)一步研究。

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