東北紅豆杉種胚形態(tài)發(fā)育調(diào)控技術(shù)和育苗研究

摘要：以東北紅豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.）果實(shí)成熟后的種子為供試材料，通過(guò)多因子交叉重復(fù)試驗(yàn)對(duì)影響東北紅豆杉種胚發(fā)育的主要因素及其水平進(jìn)行了探討，旨在篩選并確定調(diào)控東北紅豆杉種胚形態(tài)發(fā)育的主要因素及其適宜水平。結(jié)果表明，東北紅豆杉種胚發(fā)育的調(diào)控方法和主要因素及其水平為以飽和碳酸鈉溶液浸泡種子20～30 min除油脂后用粗沙去除部分種皮，再用1.80 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、2.20 mg/L赤霉素（GA3）和0.30 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）混合溶液浸泡36 h，將種子與河沙（1∶3）混合，進(jìn)行155 d的變溫處理，變溫幅度和時(shí)間：白天溫度為（23±2） ℃，處理10 h，夜間溫度為（15±2） ℃，處理14 h，子葉胚完全分化率98.0%，種子發(fā)芽率95.0%以上。

關(guān)鍵詞：東北紅豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.）；種胚；形態(tài)發(fā)育；調(diào)控技術(shù)；育苗

中圖分類號(hào)：S791.49 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1621-04

東北紅豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.）又稱紫杉、赤板松，為紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木，該樹(shù)種在長(zhǎng)白山區(qū)數(shù)量稀少，分布區(qū)域十分狹窄，僅在吉林省石湖自然保護(hù)區(qū)內(nèi)有較大的種群面積，其他區(qū)域僅有零星分布。東北紅豆杉不僅是材用植物，也是重要的藥用植物，其莖、枝、葉和根可入藥，主要成分含紫杉醇、紫杉?jí)A、雙萜類化合物，具有抗癌功能[1]，并有抑制糖尿病及治療心臟病的功效。此外種子還可以榨油等，也可作東北及華北地區(qū)的綠化及造林樹(shù)種。目前，東北紅豆杉主要用插條扦插繁殖，種苗大多為灌木型，不適合東北紅豆杉的造林，加之人們對(duì)野生資源亂采濫挖，導(dǎo)致野生資源受到滅絕性威脅；種子苗均為喬木型，但種子繁殖發(fā)芽率極低，種子播種后當(dāng)年不萌發(fā)，2～3年后僅極少數(shù)萌發(fā)，因此，東北紅豆杉大規(guī)模人工栽培、開(kāi)發(fā)和利用受到極大限制。

研究[2-4]表明，在組織培養(yǎng)中，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)搭配使用可誘導(dǎo)植物體細(xì)胞形成胚性愈傷組織，胚性愈傷組織可進(jìn)一步分化出胚胎，胚胎相當(dāng)于種子中的種胚，可直接發(fā)育形成完整的植株。為此，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育原理對(duì)東北紅豆杉種胚發(fā)育進(jìn)行激素和變溫處理同步調(diào)控的方法，以期篩選確定影響種胚發(fā)育的主要因素及其水平，從而解決東北紅豆杉種子萌發(fā)和育苗中存在的困難，為東北紅豆杉大規(guī)模人工栽培提供種子處理和育苗技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

10月上旬采集東北紅豆杉成熟果實(shí)（紫紅色），用水將種子和果肉分離后洗出成熟種子。用飽和碳酸鈉溶液浸泡種子20～30 min除油脂后，倒掉碳酸鈉溶液用清水沖洗種子3次，再用粗河沙與種子混合（2∶1）后將外種皮搓掉一部分保留薄薄一層（保障種胚對(duì)水、藥液的吸收）。然后將種子連同河沙用不同濃度的6-BA、赤霉素（GA3）和2，4-D混合溶液浸泡36 h，3種激素濃度初步控制在6-BA 1.20～1.70 mg/L、GA3 1.50～2.00 mg/L和2，4-D 0.50～1.00 mg/L，再均勻拌入河沙（使種子與河沙比達(dá)到1∶3）后裝入木槽中，覆蓋塑料薄膜置于室內(nèi)進(jìn)行變溫處理，相對(duì)濕度控制在70%左右。

1.2 影響東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的主要因素及水平篩選

經(jīng)過(guò)“1.1”中方法將種子浸泡裝箱后開(kāi)始變溫處理，變溫幅度和時(shí)間：白天溫度為（23±2） ℃，處理10 h，夜間溫度為（15±2） ℃，處理14 h，初步處理期限為50～125 d。期間每15 d取種子觀察種胚發(fā)育情況，按每100粒種子子葉胚完全分化率（即子葉胚后期）為考察對(duì)象，子葉胚完全分化率=子葉胚完全分化數(shù)/100×100%。為提高東北紅豆杉種胚子葉胚的完全分化率，采用均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)試驗(yàn)[5，6]，選用U12（124）和U8（84）均勻表，每處理100粒種子，重復(fù)3次取平均值。對(duì)照組采用同樣數(shù)量的種子用清水浸泡36 h后僅采用變溫處理（處理時(shí)間和變溫幅度同上），篩選確定影響東北紅豆杉種胚完全發(fā)育的6-BA、GA3、2，4-D和處理時(shí)間的適宜水平。

1.3 播種和苗期管理

經(jīng)過(guò)處理后的種子（子葉胚已完全分化）可直接均勻散播于做好的畦上，并用細(xì)土覆蓋，土層約為0.4 cm，再覆蓋適量腐熟落葉松松針，澆透水，等待種子發(fā)芽。種子發(fā)芽且子葉完全展開(kāi)后，每隔15 d用噴壺于葉表面和背面噴施1次0.1%的磷酸二氫鉀溶液，苗期可根據(jù)情況噴灑3%的代森錳鋅以防止根腐病。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后摸索出影響東北紅豆杉種胚子葉胚完全發(fā)育主要因素的顯著性，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)一步補(bǔ)充試驗(yàn)，篩選確定影響東北紅豆杉種胚完全分化率主要因素的適宜水平。均勻設(shè)計(jì)采用Uniform Design 3.0V軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的主要因素顯著性初步篩選

根據(jù)“1.1”和“1.2”中方法，進(jìn)行12個(gè)水平的處理，同時(shí)開(kāi)展1個(gè)水平的對(duì)照試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表1）經(jīng)分析處理后，可得回歸方程為Y=-12.9+25.8 X1+37.9 X2-24.3 X3+0.058 X4，顯著性水平α=0.05，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.988 5，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=1.450 0，檢驗(yàn)值F=74.76﹥臨界值F（0.05，4，7）=4.120，回歸方程具有顯著性，表明6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時(shí)間均對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚的發(fā)生影響顯著。計(jì)算6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時(shí)間對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)生的貢獻(xiàn)值和貢獻(xiàn)率可知，U1=160，U1/U=25.3%；U2=248，U2/U=39.3%；U3=142，U3/U=22.5%；U4=13.1，U4/U=2.07%。

2.2 6-BA、GA3、2，4-D濃度交叉配比和變溫處理時(shí)間對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的影響

6-BA、GA3和變溫處理時(shí)間與子葉胚發(fā)生率呈正相關(guān)，而2，4-D與子葉胚發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，變溫處理時(shí)間對(duì)東北紅豆杉子葉胚發(fā)生率的貢獻(xiàn)雖小，但變溫處理時(shí)間在東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)生過(guò)程中同樣起著不可缺少的作用，由此推測(cè)，6-BA和GA3質(zhì)量濃度分別高于1.70 mg/L和2.00 mg/L，2，4-D質(zhì)量濃度低于0.50 mg/L，變溫處理時(shí)間超過(guò)125 d時(shí)，東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)生率可能更高。為驗(yàn)證此推測(cè)，又以6-BA質(zhì)量濃度為1.70、1.80、1.90和2.00 mg/L，GA3質(zhì)量濃度為2.00、2.10、2.20、2.30、2.40和2.50 mg/L，2，4-D質(zhì)量濃度為0.50、0.40、0.30、0.20和0.10 mg/L，變溫處理時(shí)間為125、140、155、170、185和200 d開(kāi)展8個(gè)水平的補(bǔ)充試驗(yàn)（表2），重復(fù)3次取平均值。操作過(guò)程同“1.1”和“1.2”中方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA、GA3和2，4-D質(zhì)量濃度分別為1.80、2.20、0.30 mg/L，以及變溫處理時(shí)間為155 d時(shí)，初期的東北紅豆杉種胚子葉胚（胚芽長(zhǎng)度達(dá)1 784 μm）（圖1a）歷經(jīng)子葉胚中期（胚芽長(zhǎng)度達(dá)2 377 μm）（圖1b）完全發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚后期（胚芽長(zhǎng)度達(dá)2 850 μm）（圖1c），子葉胚完全分化率最高，達(dá)98.0%，比表1所列12個(gè)處理和對(duì)照的子葉胚完全分化率均高。

2.3 播種和苗期管理

按照“1.1”和“1.2”中方法處理后的種子（子葉胚已完全分化）不再經(jīng)過(guò)冷凍層積或GA3等處理可直接均勻散播于做好的畦上，并用細(xì)土覆蓋，土層約為0.4 cm，再覆蓋適量腐熟落葉松松針，澆透水，播種22 d后，東北紅豆杉種子開(kāi)始發(fā)芽（圖2a、圖2b），發(fā)芽率達(dá)95.0%以上，45 d后幼苗可長(zhǎng)至約10 cm（圖2c、圖2d），此時(shí)，每隔15 d用噴壺于葉表面和背面噴施1次0.1%的磷酸二氫鉀溶液，苗期可根據(jù)情況噴灑3%的代森錳鋅以防止根腐病。

3 小結(jié)與討論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，東北紅豆杉種子后熟的條件為：種子用飽和碳酸鈉溶液浸泡20～30 min去除油脂后，倒掉碳酸鈉溶液用清水沖洗種子3次，再用粗沙磨去大部分堅(jiān)硬種皮，用1.80 mg/L的6-BA、 2.20 mg/L的GA3和0.30 mg/L的2，4-D混合溶液浸泡36 h后，添加河沙使種子與河沙（1∶3）拌均后裝入木槽中，覆蓋塑料薄膜置于室內(nèi)進(jìn)行155 d的變溫處理，變溫幅度和時(shí)間：白天溫度為（23±2） ℃，處理10 h，夜間溫度為（15±2） ℃，處理14 h，子葉胚完全分化率可達(dá)98.0%。東北紅豆杉種子的子葉胚可由初期歷經(jīng)子葉胚中期最終完全發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚后期。

目前，對(duì)于果實(shí)成熟后種胚未分化完全的種子處理可分為兩個(gè)階段，第一階段為形態(tài)后熟（形態(tài)建成）階段，這類種子大多采取變溫處理促使種胚發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚；第二階段為生理后熟階段，即已形態(tài)后熟（可萌發(fā)的子葉胚）的種子進(jìn)一步采取低溫層積或用GA3等激素浸泡后再播種萌發(fā)。但這種時(shí)間較長(zhǎng)、單一的變溫處理控制較難，導(dǎo)致種胚發(fā)育緩慢、種子容易腐爛霉變，發(fā)芽率較低，這可能是單一變溫處理的種子種胚發(fā)育不徹底，可萌發(fā)的子葉胚種子較少等原因所致。

在東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育過(guò)程中，6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時(shí)間均對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚完全分化影響顯著。通過(guò)計(jì)算可知，6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時(shí)間對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚完全分化影響的貢獻(xiàn)率分別是25.3%、39.3%、22.5%和2.07%，說(shuō)明4個(gè)因素對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚完全分化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镚A3、6-BA、2，4-D、變溫處理時(shí)間，6-BA、GA3和2，4-D遠(yuǎn)大于變溫處理時(shí)間對(duì)東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的貢獻(xiàn)，說(shuō)明6-BA、GA3和2，4-D對(duì)種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育起主要調(diào)控作用，這可能是6-BA、GA3和2，4-D在調(diào)控過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一定量的乙烯類或過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶及淀粉酶等酶類活性發(fā)生變化[7-10]，從而加速和促進(jìn)了胚性細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程；足夠的合理變溫處理對(duì)東北紅豆杉子葉胚形態(tài)發(fā)育起到不可缺少的輔助調(diào)控作用，可能是種胚需要適當(dāng)溫變刺激才能完成乙烯類或酶類的產(chǎn)生和表達(dá)，也可能是東北紅豆杉種子在變溫處理過(guò)程中種子可溶性糖含量增加給種胚提供了利于生長(zhǎng)的足夠碳源等物質(zhì)基礎(chǔ)[11，12]。

通過(guò)適當(dāng)濃度的6-BA、GA3和2，4-D浸泡種子后，進(jìn)行合理的變溫處理，種子不需要再進(jìn)行生理后熟就可直接播種發(fā)芽，這可能是東北紅豆杉種子在處理過(guò)程中，6-BA、GA3和2，4-D的聯(lián)合作用，導(dǎo)致種子中積累了具有打破休眠作用的GA3，在東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育完全后，GA3在細(xì)胞分裂素（6-BA）的協(xié)同下發(fā)揮作用，從而解除了生理休眠或完成了生理后熟，這也正是細(xì)胞分裂素具有促使物質(zhì)（GA3）起作用的“許可”作用[13]。

東北紅豆杉是中國(guó)珍貴的植物資源，因其育苗存在的難點(diǎn)，導(dǎo)致至今未得到大規(guī)模人工栽培和推廣應(yīng)用，本研究解決了東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)育調(diào)控和育苗技術(shù)，不僅解決了種子萌發(fā)難和扦插存在生根率極低、威脅野生資源等問(wèn)題，而且克服了以往報(bào)道中需要變溫處理后再進(jìn)行生理后熟的復(fù)雜過(guò)程[14-16]，具有處理東北紅豆杉時(shí)間短、可操作性強(qiáng)、發(fā)芽率極高等優(yōu)點(diǎn)，屬集成一步后熟技術(shù)，可推廣應(yīng)用于東北紅豆杉的工廠化育苗和規(guī)?；耘?。

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