三種生境少孢節(jié)叢孢生長(zhǎng)特性和捕食效力比較

摘要：比較分離自溫泉、淡水及土壤的捕食線蟲真菌——少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）的生長(zhǎng)特性及捕食效力。通過(guò)測(cè)定三種生境少孢節(jié)叢孢在不同溫度、pH及有氧和無(wú)氧條件下的生長(zhǎng)率及其在最適培養(yǎng)條件下對(duì)線蟲的捕食率，得出三種生境中少孢節(jié)叢孢的最適生長(zhǎng)溫度均為30 ℃，分離自溫泉和土壤的少孢節(jié)叢孢最適pH分別為5.5～7.0和4.5～5.5，而淡水生境少孢節(jié)叢孢對(duì)不同pH具有廣泛適應(yīng)性；淡水和溫泉生境少孢節(jié)叢孢對(duì)無(wú)氧環(huán)境有一定的耐受性，而土壤生境少孢節(jié)叢孢在無(wú)氧環(huán)境下生長(zhǎng)率低至1.24 cm/5 d。三種生境的少孢節(jié)叢孢捕食效力沒有顯著性差異。

關(guān)鍵詞：生境；少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）；生長(zhǎng)特性；捕食效力

中圖分類號(hào)：S476.15 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1609-03

線蟲病是動(dòng)植物的一大類寄生蟲病，每年給農(nóng)牧業(yè)造成巨大的損失[1，2]。長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物對(duì)寄生蟲病進(jìn)行防治，易使蟲體產(chǎn)生抗藥性，且化學(xué)藥物的某些有害成分排出機(jī)體后，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，進(jìn)而影響自然界的生態(tài)平衡；藥物殘留成分隨著畜產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品——奶、蛋、肉、蔬菜、水果等進(jìn)入人體，最終對(duì)人體健康造成危害。因而用捕食線蟲真菌對(duì)寄生線蟲進(jìn)行生物防治，可以避免上述問(wèn)題的產(chǎn)生，無(wú)論從經(jīng)濟(jì)效益還是從社會(huì)效益來(lái)看，其發(fā)展和應(yīng)用的前景都是巨大的[3]。國(guó)內(nèi)外在農(nóng)作物線蟲的生物防治上已有了商品化的食線蟲真菌制劑。從自然環(huán)境中篩選捕食線蟲真菌并對(duì)其生長(zhǎng)特性及捕食效力測(cè)定是捕食線蟲真菌作為生防菌株篩選的重要環(huán)節(jié)之一，而不同生境捕食線蟲真菌的生長(zhǎng)特性及捕食效力是否存在差異，目前還沒有相關(guān)報(bào)道。少孢節(jié)叢孢是目前研究最為全面的捕食線蟲真菌之一[4-10]。近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室先后從大理周邊環(huán)境分離得到不同生境的少孢節(jié)叢孢菌株，旨在比較來(lái)自溫泉、淡水和土壤的少孢節(jié)叢孢菌株在不同溫度、pH、有氧和無(wú)氧條件的生長(zhǎng)特性及其捕食效力的差異，探討不同生境對(duì)捕食線蟲真菌適應(yīng)能力的影響，研究結(jié)果可為今后生防捕食線蟲真菌的篩選和應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 三種生境少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）菌株由大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 0.4 g/L 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）：稱取40 g新鮮玉米粉，加入1 000 mL去離子水，微火煮沸1 h，補(bǔ)足水分至1 000 mL，用紗布過(guò)濾后，取濾液10 mL，加990 mL去離子水，再加入20 g瓊脂粉，經(jīng)121 ℃ 30 min高壓滅菌后，傾注于直徑為60 mm的滅菌玻璃培養(yǎng)皿中備用。不同pH培養(yǎng)基配制方法同上，然后用1 mol/L NaOH和HCl分別調(diào)整pH至4.5～8.5，經(jīng)121 ℃ 30 min高壓滅菌后，傾注于直徑為60 mm的滅菌玻璃培養(yǎng)皿中備用。

1.1.3 線蟲幼蟲混懸液 全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus redivivus）由農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，制備成線蟲幼蟲混懸液（約5 000條/mL）備用。

1.2 生長(zhǎng)率比較

1.2.1 不同溫度下生長(zhǎng)率的比較 取20 ℃ 0.4 g/L CMA中培養(yǎng)7 d的3株少孢節(jié)叢孢，在培養(yǎng)基邊緣切取5 mm×5 mm的小塊，分別接種于pH 6.0～6.2的0.4 g/L CMA上，每種菌株分為9組，每組含3個(gè)培養(yǎng)基，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下培養(yǎng)，5 d后測(cè)算其生長(zhǎng)率。

1.2.2 不同pH下生長(zhǎng)率的比較 取20 ℃ 0.4 g/L CMA中培養(yǎng)7 d的3種菌株，在培養(yǎng)基邊緣切取5 mm×5 mm的小塊，接入制備好的CMA固體培養(yǎng)基中。每種菌株分為9組，分別置于pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的培養(yǎng)基中，每組含3個(gè)培養(yǎng)基，做好標(biāo)記后放入30 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。接種次日開始每天定時(shí)測(cè)量1次菌落直徑，直至長(zhǎng)滿平板。然后測(cè)算其生長(zhǎng)率。

1.2.3 有氧和無(wú)氧條件下生長(zhǎng)率的比較 每種菌株分為2組，每組含3個(gè)培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基和接種方法同前。接種菌絲后，分別置于30 ℃有氧和無(wú)氧條件下培養(yǎng)，5 d后分別進(jìn)行生長(zhǎng)率的測(cè)定。

1.3 三種菌株捕食線蟲效力比較

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)組，每組3次重復(fù)。第1、2、3組分別接種三種生境少孢節(jié)叢孢菌株，第4組為對(duì)照組（無(wú)菌株）。將各組置于各自最適培養(yǎng)條件下，5 d后，每個(gè)平皿內(nèi)加入幼蟲懸液1 mL（5 000 條/mL），在體視顯微鏡下檢查其活力，3 d后統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡率。按下列公式計(jì)算出菌株捕食線蟲的效力，用百分率表示。試驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

R=X/（X+Y）×100%。其中，R為捕食率，X為被捕獲的蟲體數(shù)，Y為自由活動(dòng)的蟲體數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定各組捕食線蟲真菌的菌落直徑，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同處理試驗(yàn)結(jié)果間的差異顯著性，采用新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)率比較

2.1.1 不同溫度下生長(zhǎng)率比較 由表1可見，三種生境的少孢節(jié)叢孢最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。統(tǒng)計(jì)分析表明此溫度條件下，真菌的生長(zhǎng)速度與其他溫度間差異顯著。

2.1.2 不同pH下生長(zhǎng)率的比較 由表2可見，三種生境捕食線蟲真菌生長(zhǎng)最適pH不同。方差分析表明，分離自淡水的捕食線蟲真菌在pH 5.0、5.5時(shí)，其生長(zhǎng)率差異顯著，在pH 7.0、7.5時(shí)，真菌生長(zhǎng)較好；分離自土壤的捕食線蟲真菌在pH 4.5～5.5之間，真菌生長(zhǎng)較好；分離自溫泉的捕食線蟲真菌在pH 5.5～7.0之間，真菌生長(zhǎng)較好。

2.1.3 有氧及無(wú)氧環(huán)境下生長(zhǎng)率比較 由表3可見，淡水和溫泉生境的少孢節(jié)叢孢在有氧和無(wú)氧條件下的生長(zhǎng)率差異不顯著（P>0.05），而土壤生境少孢節(jié)叢孢在無(wú)氧條件下的生長(zhǎng)率下降明顯，生長(zhǎng)率差異顯著。

2.2 三種菌株捕食率的比較

三種生境條件下菌株捕食率統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）表明，在淡水、溫泉和土壤三種生境的少孢節(jié)叢孢其捕食效力差異不顯著（P>0.05），且三者與對(duì)照組相比，捕食效力均達(dá)60%以上。

3 討論

不同溫度下的生長(zhǎng)率比較結(jié)果顯示，不同生境少孢節(jié)叢孢的最適生長(zhǎng)溫度均為30 ℃，表明同一地區(qū)不同生境條件下的少孢節(jié)叢孢對(duì)溫度的適應(yīng)性相同。楊曉野等[8]對(duì)少孢節(jié)叢孢CIMHI菌株生長(zhǎng)溫度范圍測(cè)定為15～30 ℃，其中以20 ℃生長(zhǎng)最好。而鄢小寧等[11]對(duì)少孢節(jié)叢孢HNQ11菌株最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定值為25 ℃，說(shuō)明少孢節(jié)叢孢存在地區(qū)溫度適應(yīng)性的差異。提示在篩選生防捕食線蟲真菌的時(shí)候，盡量從本地區(qū)篩選，縮短菌種的適應(yīng)周期，以更好更快地發(fā)揮其捕食效力。

不同pH條件下，土壤中的少孢節(jié)叢孢在pH 4.5～5.5之間，即偏酸性的條件下生長(zhǎng)比較好；而分離自溫泉的少孢節(jié)叢孢在不同pH條件下生長(zhǎng)速率波動(dòng)較大，在pH 5.5～7.0之間的生長(zhǎng)較好；分離自淡水的少孢節(jié)叢孢在不同pH條件下生長(zhǎng)速率沒有明顯差異。從不同菌株的生長(zhǎng)環(huán)境來(lái)看，出現(xiàn)這種情況的原因是由于土壤偏酸性[12]，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在這種環(huán)境中的少孢節(jié)叢孢已經(jīng)適應(yīng)這種生存環(huán)境；溫泉中的少孢節(jié)叢孢采自于大理彌渡徂萊溫泉，溫泉水pH為6.8，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的最適pH為6.5，兩者差異不大；淡水少孢節(jié)叢孢分離自洱海，洱海水質(zhì)1986～1996年偏堿性[13]，隨著洱海保護(hù)效果的顯現(xiàn)，洱海水pH已經(jīng)逐漸降低，但仍然會(huì)隨著季節(jié)變動(dòng)[14]，導(dǎo)致分離自洱海的淡水捕食線蟲真菌具有廣泛的酸堿適應(yīng)能力。

本次試驗(yàn)從溫泉和淡水篩選到的少孢節(jié)叢孢對(duì)無(wú)氧環(huán)境的耐受力明顯好于土壤生境中的少孢節(jié)叢孢菌株，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于試驗(yàn)所采集土樣為5～15 cm土壤，其中氧含量較高所致。試驗(yàn)結(jié)果顯示，土壤生境中的捕食線蟲真菌可能不適合作為動(dòng)物腸道寄生線蟲生防菌株來(lái)源（動(dòng)物腸道為厭氧環(huán)境）。結(jié)合不同pH下生長(zhǎng)率的比較結(jié)果，推測(cè)水環(huán)境中的捕食線蟲真菌對(duì)動(dòng)物腸道環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)。而一直以來(lái)，土壤被認(rèn)為是微生物的天然種質(zhì)資源庫(kù)，目前已經(jīng)分離到的捕食線蟲真菌也絕大多數(shù)來(lái)源于土壤，因此有必要加強(qiáng)對(duì)水生捕食線蟲真菌資源的開發(fā)和應(yīng)用研究。

三種少孢節(jié)叢孢在其最適培養(yǎng)條件下對(duì)全齒復(fù)活線蟲的捕食率測(cè)定結(jié)果分別為：溫泉63.30%，土壤62.73%，淡水61.50%，差異不顯著，這是否說(shuō)明同一地區(qū)不同生境捕食線蟲真菌的捕食能力趨同，還有待對(duì)更多不同生境同種捕食線蟲真菌捕食率進(jìn)行比較后方可確定。莫明和等[15]測(cè)定了少孢節(jié)叢孢對(duì)松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucronatus）的捕食率，測(cè)定結(jié)果分別為31.15%和31.12%，鄢小寧等[11]發(fā)現(xiàn)少孢節(jié)叢孢HNQ11菌株在25 ℃條件下對(duì)松材線蟲幼蟲的捕食率高達(dá)87%，表明不同地區(qū)分離到的少孢節(jié)叢孢對(duì)同種或不同線蟲的捕食效率都存在較大差異，在生防菌株的選擇上要充分考慮到菌株的地區(qū)差異性及線蟲的種類差別。

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