酸性染料比色法測定苦馬豆中總生物堿含量

摘要：采用酸性染料比色法測定苦馬豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]中總生物堿含量。以苦參堿為標準品，溴麝香草酚藍為染色液，在pH 7.6緩沖溶液中與生物堿反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用氯仿萃取，萃取液于414 nm處測定其吸光度。應(yīng)用建立的酸性染料比色法對寧夏不同地區(qū)采集的苦馬豆樣品中總生物堿含量進行分析。結(jié)果表明，苦參堿在0.001 7～0.013 3 μg/μL內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=50.549 0x-0.047 7（R2=0.999），苦參堿的平均回收率為103.17（RSD為1.70%），測得寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆中總生物堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.026%、0.024%、0.017%。該方法靈敏、可靠、操作簡便，可用于苦馬豆中總生物堿含量的測定。

關(guān)鍵詞：苦馬豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]；酸性染料比色法；總生物堿；苦參堿

中圖分類號：R927.2；O657.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1710-03

苦馬豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]是豆科苦馬豆屬草本植物，別名羊卵蛋、羊尿泡、尿泡草、紅花苦豆子等，廣泛分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、新疆等地[1]。苦馬豆全草、果可入藥，民間用于治療腎炎、慢性肝炎、肝硬化腹水等疾病?？囫R豆含有黃酮、生物堿、異環(huán)烷、木脂素、酚酸、萜及甾醇類化合物[2]。目前對苦馬豆的總黃酮含量進行了深入分析，但總生物堿含量的研究尚未見報道。研究表明，苦馬豆中含有苦參堿[3]、苦馬豆堿（Spherophysine）[4]、苦馬豆素（Swainonine）[5]、麥角堿（Ergotine）[1]等多種生物堿，該類生物堿具有調(diào)節(jié)血壓、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、治療產(chǎn)后出血和帕金森病等作用[2，3，6]。因此，測定苦馬豆總生物堿含量可對苦馬豆的藥材質(zhì)量評價和臨床應(yīng)用提供重要的科學(xué)依據(jù)?？囫R豆也是一種有毒植物，家畜過量采食會導(dǎo)致中毒死亡[7]，給草原畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，有報道生物堿可能是導(dǎo)致動物中毒的重要原因[4]，測定苦馬豆中生物堿的含量，也可為動物苦馬豆中毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。

目前，用于植物樣品生物堿測定的方法有薄層色譜掃描法、高效液相色譜法（HPLC）、高效毛細管電泳法（HPCE）、重量法、酸堿滴定法、酸性染料比色法等。薄層色譜掃描法、高效液相色譜法、高效毛細管電泳法靈敏度高，測量準確，適用于對植物樣品中各生物堿組分的定量分析，但所需設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，技術(shù)要求較高，一般無法檢測在紫外可見光區(qū)吸收較弱或無吸收的化合物。而重量法、酸堿滴定法的靈敏度較低，誤差較大，一般用于總生物堿含量的粗略評估。酸性染料比色法是根據(jù)生物堿在一定pH介質(zhì)中與酸性染料發(fā)生反應(yīng)，形成可被紫外分光光度計檢測的具有生色基團絡(luò)合物的原理建立的方法，該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便、樣品處理簡單等特點，近年來已廣泛用于苦參、苦豆子等中藥材中總生物堿含量的測定[8-12]。本研究擬以苦參堿為對照品，用酸性染料比色法，對寧夏不同地區(qū)采集的苦馬豆總生物堿含量進行測定，為苦馬豆藥材質(zhì)量評價、臨床應(yīng)用和動物苦馬豆中毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物樣品 苦馬豆全草，采于寧夏平羅縣、鹽池縣和銀川市，采集后風干、粉碎備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 苦參堿標準品購自中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號為110805-200508；溴麝香草酚藍、甲醇、乙醇、氯仿、氨水、氯化銨等均為分析純。DU800型紫外分光光度計（美國貝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 苦參堿標準品溶液的制備 標準品溶液的配制：精密稱取10.0 mg苦參堿標準品，用體積分數(shù)為50%乙醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成1 mg/mL標準品溶液。

1.2.2 供試樣品溶液的制備 稱取苦馬豆草粉1.00 g，用濾紙包好后放入索式提取器，加入100 mL甲醇，80 ℃提取24 h，取出提取液，濃縮至干，殘渣用5 mL體積分數(shù)為2%乙酸溶液溶解。將乙酸溶液加入裝有5 g 732型陽離子交換樹脂（NH4+型）的分離柱中，靜置過夜后先加入去離子水洗脫樹脂，待洗脫液呈中性時，再用1 mol/L的氨水溶液洗脫，收集水洗脫液，濃縮至干，用1 mL乙醇溶解，離心后取上清液用體積分數(shù)為50%乙醇稀釋，備用。

1.2.3 最大吸收波長的確定 分別取標準品溶液20 μL、供試樣品溶液100 μL，分別加入具塞試管中，揮干溶劑后，每管中分別加入pH 7.6的質(zhì)量體積分數(shù)為0.012 5%的溴麝香草酚藍溶液6 mL，氯仿6 mL，然后倒入分液漏斗中劇烈振蕩2 min，靜置2 h。取氯仿層溶液，置于紫外分光光度計中，在300～900 nm內(nèi)掃描，測定其最大吸收波長。

1.2.4 標準曲線的繪制 取標準品溶液0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL，分別加入9支具塞試管中并揮干溶劑，按“1.2.3”項下方法處理后，于紫外分光光度計測定其414 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標（y）、苦參堿濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，得出線性回歸方程并確定線性范圍。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗 取標準品溶液60 μL，加入具塞試管中并揮干溶劑，按“1.2.3”項下方法處理后，分別在0、1、2、3、4、6、8、10、12 h時測定其414 nm處的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算樣品含量，并計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.6 精密度試驗 取5份標準品溶液，每份50 μL，加入具塞試管中并揮干溶劑，按 “1.2.3”項下方法進行處理，然后置于紫外分光光度計中測其414 nm處的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算樣品含量，并計算RSD。

1.2.7 加標回收試驗 稱取已知生物堿含量的苦馬豆樣品（266.34 μg/g）1 g，按“1.2.2”項下方法分別制備樣品溶液，將樣品溶液平均分為5份，加入苦參堿標準品溶液60 μL。將每份樣品溶液加入具塞試管中并揮干溶劑，按“1.2.3”項下方法處理后測其414 nm處的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算回收率，并計算RSD。

1.2.8 樣品含量的測定 精密稱取寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆草粉各3份，每份1 g，按“1.2.2”項下方法制備供試樣品溶液，從每份樣品溶液中各取100 μL加入具塞試管中并揮干溶劑。按“1.2.3”項下方法處理后在414 nm處測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算苦馬豆樣品中總生物堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長

經(jīng)測定，供試樣品溶液最大吸收波長分別在355和414 nm處有較強吸收，但414 nm處吸收最強（圖1）。苦參堿標準品溶液在414 nm處有最強吸收，故本試驗采用414 nm作為測定生物堿的吸收波長。

2.2 標準曲線的繪制

以苦參堿標準品溶液414 nm的吸光度為縱坐標（y），苦參堿濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=50.549 0x-0.047 7（R2=0.999），苦參堿檢測濃度在0.001 7～0.013 3 μg/μL內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 穩(wěn)定性、精密度及加標回收試驗

經(jīng)測定，本方法穩(wěn)定性試驗和精密度試驗的RSD分別為4.26%（表1）和5.29%（表2），說明該方法精密度較好，供試樣品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。加標回收試驗結(jié)果如表3所示，平均回收率為104.31%，RSD為1.70%。表明系統(tǒng)誤差符合分析條件，測試結(jié)果準確度高，可靠性強。

2.4 樣品中生物堿含量的測定

測得寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆樣品中生物堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.026%、0.024%和0.017%（表4）。

3 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明，寧夏不同地區(qū)采集的苦馬豆樣品中總生物堿含量差異較大，其中寧夏平羅縣和鹽池縣采集的苦馬豆樣品中總生物堿含量較高，其生物堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.026%、0.024%，而銀川市采集的樣品中生物堿含量較低（0.017%）?？囫R豆廣泛分布于中國西北地區(qū)，不同的生長環(huán)境、氣候可能對其生物堿含量產(chǎn)生重要影響。因此，需進一步對我國不同區(qū)域苦馬豆中生物堿含量進行分析，從而為苦馬豆的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

楊毅恒[13]用苦參堿為標準品測定苦參藥材中生物堿的含量，在pH 7.6條件下，與溴麝香草酚藍絡(luò)合成可被氯仿萃取的有色離子對，在417 nm處有最大吸收，建立的方法專屬性強，結(jié)果準確可靠。在本試驗中，當緩沖溶液pH為7.6時，苦馬豆與溴麝香草酚藍絡(luò)合生成可被氯仿萃取的具有生色基團的化合物，在355和414 nm處均出現(xiàn)較大吸收峰，其中414 nm處吸收最強。而對照標準品苦參堿與酸性染料反應(yīng)后，僅在414 nm處有最大吸收峰，故本試驗選擇414 nm作為苦馬豆總生物堿的檢測波長。經(jīng)酸性染料處理的待檢溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定，精密度較好，系統(tǒng)誤差較小，測試結(jié)果準確度較高，可靠性較強。表明該方法可用于苦馬豆總生物堿的定量分析，并測得寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆中總生物堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.026%、0.024%和0.017%。

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