產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌Bacillus BS—8的生物學(xué)特性

摘要：研究石油降解菌BS-8（Bacillus sp.）的生長(zhǎng)特性及影響其產(chǎn)生物表面活性劑的因素。通過測(cè)定BS-8發(fā)酵液的OD600 nm、表面張力、排油圈直徑推測(cè)其生物表面活性劑的產(chǎn)生方式；考察了碳源、氮源、溫度、pH、NaCl濃度對(duì)其產(chǎn)生物表面活性劑的影響。結(jié)果表明，菌株BS-8生物的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型，發(fā)酵液的表面張力隨菌體數(shù)量的增加而降低，排油圈直徑與發(fā)酵液中表面活性劑含量呈正相關(guān)；菌株BS-8高產(chǎn)生物表面活性劑的碳源、氮源分別為葡萄糖、酵母膏，最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適pH 7.0，最適NaCl濃度為20 g/kg。

關(guān)鍵詞：生物表面活性劑；石油降解菌BS-8；生長(zhǎng)相關(guān)型；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1567-03

生物表面活性劑（Biosurfactants，簡(jiǎn)稱BS）是由微生物在一定條件下代謝合成的分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)存在極性親水基和非極性疏水基，能夠顯著降低水溶液表面張力的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，具有用量少、選擇性好、低毒、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、制藥工業(yè)以及環(huán)境工程等領(lǐng)域。許多利用微生物修復(fù)石油污染的研究表明，生物表面活性劑起到了非常重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)條件（如C、N、P濃度）和培養(yǎng)條件（如pH、溫度、離子強(qiáng)度、接種量、種齡等）對(duì)微生物產(chǎn)表面活性劑都有不同程度的影響，碳源對(duì)微生物所產(chǎn)表面活性劑的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)有決定作用，烴類物質(zhì)的存在尤其是烴鏈長(zhǎng)度對(duì)培養(yǎng)基中微生物所產(chǎn)表面活性劑的濃度也會(huì)有著顯著的影響[3]。所以，篩選高產(chǎn)生物表面活性劑的菌株及對(duì)影響代謝產(chǎn)物的因素研究具有極其重要的意義。課題組從長(zhǎng)期受石油污染的土壤中篩選到一組產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，對(duì)其中一株高產(chǎn)生物表面活性劑的菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)表面活性劑的關(guān)系進(jìn)行了研究，并對(duì)影響其產(chǎn)表面活性劑的因素進(jìn)行了探討，為提高生物表面活性劑的發(fā)酵產(chǎn)率及開發(fā)應(yīng)用打下一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株BS-8（Bacillus sp.），從長(zhǎng)期受石油污染的土壤中篩選到[4]。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）： 胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20.0，（NH4）2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 2.0，Na2HPO4 2.0，CaCl2·H2O 0.005；pH 7.0～7.2

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定方法 排油圈的測(cè)定參考王大威等[5]的方法，表面張力的測(cè)定參考曹娟等[6]的方法。

1.2.2 菌株BS-8的生長(zhǎng)與產(chǎn)表面活性劑的動(dòng)態(tài)關(guān)系試驗(yàn) 將菌株BS-8以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔6 h取樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的OD600 nm，并測(cè)定離心后的發(fā)酵上清液的表面張力及排油圈直徑。

1.2.3 影響菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的因素試驗(yàn) 微生物的生長(zhǎng)需要充足的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還需要合適的培養(yǎng)條件如溫度、pH、滲透壓等。為確定菌株BS-8的最佳生長(zhǎng)及產(chǎn)表面活性劑的條件，研究了碳源、氮源、溫度、pH和NaCl濃度對(duì)菌株產(chǎn)表面活性劑的影響。按照5%的接種量，將菌株BS-8于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h，并測(cè)定離心后的發(fā)酵上清液的排油圈直徑。具體設(shè)計(jì)見表 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑與菌體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)關(guān)系

菌株BS-8在發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定發(fā)酵液的OD600 nm及離心上清的表面張力和排油圈直徑，結(jié)果如圖1所示。有研究表明，生物表面活性劑是細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)有相關(guān)型和非相關(guān)型兩類[7]。一定濃度范圍內(nèi)，發(fā)酵液中表面活性劑的含量與表面張力呈反比[8]。發(fā)酵液的表面張力反映了菌株產(chǎn)表面活性劑的能力。圖1表明，在發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株在6 h時(shí)已開始產(chǎn)表面活性劑，6～30 h內(nèi)菌體數(shù)量迅速增加，發(fā)酵液的表面張力隨菌體數(shù)量的增加而降低，表面張力快速下降（從63.2 mN/m下降為39.4 mN/m）。隨著菌體數(shù)量緩慢增長(zhǎng)，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。30～54 h間細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高值，發(fā)酵液的表面張力也降至最低值34.1 mN/m。54～72 h間，菌體數(shù)量有所下降，表面張力有所增加。

排油圈直徑與發(fā)酵液中表面活性劑含量呈正相關(guān)，與表面張力呈負(fù)相關(guān)，即表面張力越大，排油圈直徑越小。由圖1可知，6～30 h上清液的表面張力快速下降，而排油圈直徑從11 mm增大到62 mm，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，上清液表面張力持續(xù)下降但降速減慢，排油圈直徑維持在62 mm左右。據(jù)以上分析，推測(cè)菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型。

2.2 不同因素對(duì)菌株BS-8產(chǎn)生表面活性劑的影響

2.2.1 菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的最適碳源 碳源是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物必不可少的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，充足的碳源決定了菌株產(chǎn)表面活性劑的產(chǎn)量。分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，測(cè)定各發(fā)酵液的排油圈大小。從圖2可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，排油圈直徑最大達(dá)到62 mm，其他幾種碳源產(chǎn)生的排油圈均小于以葡萄糖為碳源產(chǎn)生的排油圈。即葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液中生物表面活性劑的含量最高，所以培養(yǎng)液的碳源選擇葡萄糖。

2.2.2 菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的最適氮源 分別以硫酸銨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，經(jīng)48 h的培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的排油圈大小。圖3數(shù)據(jù)表明，不同的氮源對(duì)菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的量有較大的影響。以酵母膏為氮源時(shí)，排油圈直徑最大達(dá)到66 mm，均大于其他幾種氮源產(chǎn)生的排油圈，幾種氮源的效果大小順序?yàn)榻湍父?、牛肉膏、硫酸銨、硝酸銨、尿素。

2.2.3 菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的最適溫度 菌株BS-8在不同溫度下培養(yǎng)，發(fā)酵上清液產(chǎn)生的排油圈大小也不同，說明溫度對(duì)菌株產(chǎn)表面活性劑的能力有一定的影響。由表2可知，在20～40 ℃的范圍內(nèi)菌株BS-8的排油圈直徑較大，60 ℃時(shí)仍具有產(chǎn)表面活性劑的能力，說明該菌株具有較廣的生長(zhǎng)溫度范圍。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，排油圈直徑達(dá)到67 mm。

2.2.4 菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的最適pH 菌株BS-8接種在不同pH的培養(yǎng)液中，經(jīng)振蕩培養(yǎng)，其產(chǎn)表面活性劑的能力如表3所示。不同pH下，發(fā)酵上清液產(chǎn)生的排油圈大小不同，說明pH影響菌株產(chǎn)表面活性劑的能力。由表3可知，菌株BS-8在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)排油圈直徑較大。當(dāng)pH為7.0時(shí)，排油圈直徑最大達(dá)到65 mm，發(fā)酵液中表面活性劑的含量最高。

2.2.5 菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑的最適NaCl濃度 菌株BS-8在不同NaCl濃度的發(fā)酵液中培養(yǎng)，其產(chǎn)表面活性劑的能力如表4所示。由表4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中不同濃度的NaCl對(duì)菌株產(chǎn)表面活性劑的產(chǎn)量有較大影響，菌株BS-8在NaCl濃度為10～30 g/kg 的范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好，能耐受濃度50 g/kg的NaCl， 當(dāng)NaCl濃度為20 g/kg時(shí)，排油圈直徑最大。

3 結(jié)論與討論

對(duì)生物表面活性劑的特性研究表明，其適用于石油工業(yè)和環(huán)境工程，因此生物表面活性劑的研究與開發(fā)逐漸成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[9]，生物表面活性劑的生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和酶催化法兩種。根據(jù)微生物的種類和目標(biāo)產(chǎn)物的不同將發(fā)酵法分為四種：生長(zhǎng)細(xì)胞法、代謝控制的細(xì)胞生長(zhǎng)法、休止細(xì)胞法和加入前體法[10，11]。目前只有少數(shù)產(chǎn)品走向市場(chǎng)，主要原因是生物表面活性劑的生產(chǎn)成本較高。通過選育高產(chǎn)菌株、改進(jìn)發(fā)酵工藝及提高生物表面活性劑的產(chǎn)率可以降低其成本，使其走向大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。菌株BS-8（Bacillus sp.）是從長(zhǎng)期受石油污染的土壤中篩選到的高產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，對(duì)其生長(zhǎng)與產(chǎn)表面活性劑的關(guān)系進(jìn)行了研究，并對(duì)影響其產(chǎn)表面活性劑的因素進(jìn)行了探討。菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑與菌體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)關(guān)系表明，菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長(zhǎng)相關(guān)型，排油圈直徑與發(fā)酵液中生物表面活性劑含量正相關(guān)，與表面張力負(fù)相關(guān)。以排油圈直徑表征發(fā)酵液中生物表面活性劑的含量，不同因素影響了菌株產(chǎn)表面活性劑的能力，菌株BS-8高產(chǎn)表面活性劑碳源、氮源分別為葡萄糖、酵母膏，最適培養(yǎng)溫度30 ℃，最適pH 7.0，最適NaCl濃度為20 g/kg。

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