Ca2+ 對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標的影響

摘要：以蘿卜（Raphanus sativus L.）幼苗為材料，研究外源Ca2+ 對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標可溶性糖、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。結果表明，在低溫脅迫下，MDA、可溶性糖以及Pro的含量明顯上升，SOD和POD活性先下降再上升。用不同濃度的Ca2+處理后，可溶性糖和MDA的含量相對對照組在處理后的第1天有所下降，而Pro的含量增加，POD和SOD的活性變化則與處理的時間有關。用適當濃度的Ca2+處理可以增強蘿卜幼苗對低溫的抗性，降低低溫對蘿卜幼苗的傷害。

關鍵詞：低溫脅迫；Ca2+；逆境指標；蘿卜（Raphanus sativus L.）幼苗

中圖分類號：S631.1；Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1612-06

低溫對植物的毒害效應，按低溫程度和受害情況，可分為冷害和凍害。冷害是指溫度在零攝氏度以上時，雖無結冰現(xiàn)象，仍能使喜溫植物受害甚至死亡，即零攝氏度以上的低溫對植物的傷害。冷害是喜溫植物北移的主要障礙，是喜溫作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的主要限制因子。

近年來發(fā)現(xiàn)，低溫引發(fā)的細胞內(nèi)Ca2+水平升高，在抗寒鍛煉中起著十分重要的作用。Ca2+充當?shù)蜏匦盘柕膫鬟f信使，啟動抗寒鍛煉，誘導抗寒基因的表達[1-4]。利用水母發(fā)光蛋白的轉基因植物測定Ca2+濃度等研究揭示和證實，低溫條件下由于質膜上電壓門控Ca2+通道的開放而導致了Ca2+的流入[5]。植物細胞膜感受到低溫后，將低溫信號通過Ca2+、ABA（脫落酸）等第二信使繼續(xù)向下游傳遞，其中Ca2+是低溫信號轉導時重要的第二信使[6]。張國增等[7]在研究低溫脅迫下擬南芥CBF1超表達突變體胞質中Ca2+濃度的變化時發(fā)現(xiàn)，Ca2+參與了CBF1應答低溫信號的轉導過程，且CBF1超表達突變體可能是通過提高胞質Ca2+的濃度來提高植物的抗低溫脅迫能力。由此看來，Ca2+作為胞內(nèi)的第二信使在低溫脅迫下發(fā)揮著調(diào)控細胞的重要功能。

Ca2+不僅在增強植物抵抗非生物逆境時具有重要作用，它在增強植物抗生物逆境如抗病防衛(wèi)反應中也有重要作用[8]。為此，試驗通過測定CaCl2處理后蘿卜（Raphanus sativus L.）幼苗的丙二醛（MDA）、可溶性糖和脯氨酸（Pro）濃度變化以及過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活力變化，探討外源鈣離子（Ca2+）提高植物抵抗低溫脅迫以及其他脅迫的積極作用，旨在為進一步研究Ca2+增強植物抗逆性的機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子來源

富農(nóng)正宗圓紅蘿卜，由蘇州種子公司提供。

1.2 蘿卜幼苗的培養(yǎng)和試驗處理

1.2.1 蘿卜幼苗的培養(yǎng) 將蘿卜種子用60～70 ℃的去離子水清洗數(shù)次，倒去漂浮的種子并將爛種、雜種挑去。淘洗后置于干凈的培養(yǎng)皿中待用。將種子播于底部放置濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中放一定量的種子，然后在種子上方覆蓋1張濕濾紙，加少量的去離子水（半浸沒種子），蓋好培養(yǎng)皿。最后置于25 ℃的恒溫箱中催芽。等到芽苗長至2～3 cm時撤掉上方濾紙，置于光照培養(yǎng)室中加完全培養(yǎng)液[9]進行培養(yǎng)，當幼苗莖長至10 cm左右時將所有幼苗轉移到培養(yǎng)瓶中，瓶壁避光。待幼苗長出第3片真葉時即進行脅迫試驗。在蘿卜幼苗的水培期間要保證培養(yǎng)液充足，并保持清潔。

1.2.2 試驗處理

1）溫度的選擇。參考文獻[10]和[11]，確定以5 ℃作為試驗的處理溫度。

2）試驗處理。將蘿卜幼苗分組，A——利用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；B——5 mmol/L CaCl2完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；C——10 mmol/L CaCl2完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；D——15 mmol/L CaCl2完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5 ℃、光照度33%、白天14 h、晚上10 h的恒溫培養(yǎng)箱中；另取適量幼苗置于25 ℃、光照度33%、白天14 h、晚上10 h的恒溫培養(yǎng)箱中，作為常溫對照，試驗期間保證幼苗水培營養(yǎng)液充足。然后在培養(yǎng)1、2、3、4、5 d時分別測定兩組幼苗的可溶性糖、MDA、Pro含量以及POD和SOD活性[11]。

1.3 指標測定及方法

可溶性糖、MDA、Pro含量，POD、SOD活性的測定參考文獻[9]和[12]進行。試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對蘿卜幼苗逆境指標的影響

2.1.1 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中可溶性糖含量的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后可溶性糖含量的變化如圖1所示。從圖1可以看出，與對照相比，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的可溶性糖含量明顯上升。

2.1.2 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中MDA含量的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后MDA含量變化如圖2所示。從圖2可以看出，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的MDA含量前3 d高于對照，但在處理后的第4、5天低于對照。

2.1.3 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中Pro含量的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗1、2、3、4、5 d后Pro含量的變化如圖3所示。從圖3可以看出，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的Pro含量明顯上升，只是在處理后的第1天其Pro含量低于對照。

2.1.4 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中POD活性的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后POD活性的變化如圖4所示。從圖4可以看出，與對照相比，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的POD活性明顯下降，但其活性呈現(xiàn)出隨時間延長先上升再下降再上升的趨勢。

2.1.5 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中SOD活性的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后SOD活性的變化如圖5所示。從圖5可以看出，與對照相比，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的SOD活性明顯低于對照，其活性呈現(xiàn)出隨時間先下降再上升的趨勢。

2.2 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標的影響

2.2.1 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中可溶性糖含量的影響 低溫脅迫下導致植物可溶性糖含量發(fā)生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片內(nèi)可溶性糖含量的變化如圖6所示。由圖6可以看出，低溫脅迫下只用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)蘿卜幼苗時，其可溶性糖含量隨著時間先下降再上升再下降，而用不同Ca2+處理后，其可溶性糖的含量在第1天比未經(jīng)Ca2+處理的要低，但隨著時間的延長，其可溶性糖含量不斷增加。但隨著Ca2+濃度的增加，其可溶性糖含量降低，在Ca2+濃度為15 mmol/L時，可溶性糖含量較其他處理低。

2.2.2 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中MDA含量的影響 低溫脅迫下導致植物MDA含量發(fā)生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中MDA含量的變化如圖7所示。由圖7可以看出，低溫脅迫下只用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)蘿卜幼苗時，其MDA含量隨著時間先下降再上升，但其上升的時間相對滯后。用不同濃度的Ca2+處理后，其MDA的含量在第1天比未經(jīng)Ca2+處理的要低，但隨著時間的延長，其MDA含量比未經(jīng)Ca2+處理的要高。Ca2+濃度為10 mmol/L時，MDA含量較其他處理低。

2.2.3 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中Pro含量的影響 低溫脅迫下導致植物Pro含量發(fā)生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中Pro含量的變化如圖8所示。由圖8可以看出，低溫脅迫下只用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)蘿卜幼苗時，其Pro含量隨著時間的推移逐漸上升，但其上升的幅度較小。用不同Ca2+處理后，其Pro的含量比未經(jīng)Ca2+處理的要高，且隨著時間的推移，其Pro含量升高的幅度比未經(jīng)Ca2+處理的要大，且呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢。Ca2+濃度為5 mmol/L時，Pro含量較其他處理低。

2.2.4 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中POD活性的影響 低溫脅迫下導致植物POD活性發(fā)生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中POD活性的變化如圖9所示。由圖9可以看出，低溫脅迫下只用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)蘿卜幼苗時，其POD活性隨著時間的延長先上升再下降再上升。用不同濃度Ca2+處理后，其POD活性比未經(jīng)Ca2+處理的要低；當Ca2+濃度大于5 mmol/L時，隨著時間的推移，其POD的活性整體呈上升趨勢。在Ca2+濃度為5 mmol/L時，POD活性較其他處理的要高，當Ca2+濃度為15 mmol/L時，POD活性較其他處理低。且在處理后的第4天各組（除處理A外）的POD活性達最大值。

2.2.5 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中SOD活性的影響 低溫脅迫下導致植物SOD活性發(fā)生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中SOD活性的變化如圖10所示。由圖10可以看出，低溫脅迫下只用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)蘿卜幼苗時，其SOD活性隨著時間的延長先下降再上升。用不同濃度Ca2+處理后，蘿卜幼苗葉片中SOD活性基本表現(xiàn)為隨著時間的延長先下降再升高。在Ca2+濃度為15 mmol/L時，SOD活性隨著時間的延長較其他處理高，在處理后的第4天其SOD活性達到最大。

3 小結與討論

3.1 Ca2+對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標的影響

3.1.1 對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中可溶性糖和MDA含量的影響 低溫傷害不僅破壞植物的細胞代謝，而且導致體內(nèi)生理功能發(fā)生變化，自由基的增加傷害膜系統(tǒng)，引發(fā)了細胞膜脂過氧化作用，最終產(chǎn)物MDA可以擴散到其他部位[13]。因此MDA的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關系，一定程度上反映了植物受損傷的程度。在對蘿卜幼苗進行低溫處理時，蘿卜幼苗葉片中可溶性糖的含量比常溫（25 ℃）條件下的要高。而蘿卜幼苗葉片中MDA的含量在低溫處理后的前3 d都要比常溫條件下的MDA含量要高，但隨著處理時間的延長，蘿卜幼苗葉片中MDA含量較常溫下要低。究其原因，可能與常溫條件下蘿卜幼苗大量消耗水分，完全培養(yǎng)液的濃度一定程度上會升高，對蘿卜幼苗根部造成了脅迫，導致其MDA含量隨著處理時間的延長而增加。

蘿卜幼苗在經(jīng)不同濃度Ca2+處理后的第1天，測得其可溶性糖和MDA含量比未經(jīng)Ca2+處理的蘿卜幼苗要低。即在一定程度上緩解了低溫對蘿卜幼苗的傷害，但隨著處理時間的延長，經(jīng)Ca2+處理的蘿卜幼苗可溶性糖和MDA含量比未經(jīng)Ca2+處理的蘿卜幼苗要高，猜測出現(xiàn)這一結果可能是因為在低溫脅迫下，短時施用外源的Ca2+可以迅速增加植物細胞內(nèi)的Ca2+含量，引發(fā)細胞內(nèi)的信號反應，幫助細胞度過危機。但隨著外源Ca2+處理時間的延長，低溫所造成的植物細胞內(nèi)的滲透脅迫由于額外的鈣離子鹽進一步加強了其滲透脅迫，因此利用不同濃度的Ca2+處理后的蘿卜幼苗中可溶性糖和MDA含量在處理后的第2天開始迅速增加。同時還發(fā)現(xiàn)，在利用Ca2+處理后的第1天，隨著Ca2+濃度的增加，蘿卜幼苗所產(chǎn)生的可溶性糖和MDA含量越少，也就是蘿卜幼苗受低溫脅迫程度越小。這也許可以通過低溫誘導細胞內(nèi)Ca2+增加的時空特征不同來解釋，Campbell等[14]利用煙草幼苗在逐步降溫的過程中發(fā)現(xiàn)，根和植物地上部分表現(xiàn)出敏感性不同，當溫度從25 ℃降到17～18 ℃時，引發(fā)根細胞質基質Ca2+水平的升高；當溫度進一步降低到10 ℃時，則在子葉中觀察到細胞質基質的Ca2+增加；當溫度降到2 ℃時，根終止了反應，但子葉仍在繼續(xù)。總之，無論是煙草還是擬南芥，均表現(xiàn)為根在較高溫度下發(fā)生反應，地上部分則在較低溫度下發(fā)生反應[15]。由此可見，出現(xiàn)如此結果不僅與處理時所使用的不同的Ca2+濃度有關，還與植物自身組織差異有關。

3.1.2 對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中Pro含量的影響 在逆境脅迫下（旱、熱、冷、凍），植物可通過積累一定量的溶質降低水勢，維持植物體內(nèi)的水分平衡，保證植物的正常生長。這類物質包括一系列的含氮化合物，如Pro、多胺等，分布最廣的是Pro[16]。Pro積累的原初部位主要是葉，通過兩條途徑合成，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑。Pro在滲透調(diào)節(jié)方面的作用，一是作為細胞質的滲透調(diào)節(jié)物質，二是作為防脫水劑。它是無毒的中性溶質，也是水溶性最大的一種氨基酸。在一定的干旱范圍內(nèi)，許多植物是通過滲透調(diào)節(jié)作用來維持細胞一定的含水量和膨壓，從而維持細胞的正常功能。當對蘿卜幼苗進行低溫處理時，其Pro的含量較常溫條件明顯升高。利用不同濃度的Ca2+處理后，各處理蘿卜幼苗中的Pro含量比未用Ca2+處理的要高。從彭志紅等[15]描述的植物Pro的合成途徑中發(fā)現(xiàn)，Pro的合成并未受Ca2+信號途徑的調(diào)節(jié)，因此，在這里使用不同濃度的鈣鹽處理反而加強了蘿卜幼苗的滲透脅迫。

3.1.3 對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中POD、SOD活性的影響 POD是防止膜脂過氧化的主要酶，在低溫脅迫下能夠保持膜的完整性。SOD的作用是清除超氧自由基，同時產(chǎn)生歧化產(chǎn)物過氧化氫。POD保護酶系統(tǒng)主要起酶促降解過氧化氫的作用，避免因過氧化氫的過量積累導致毒性更大的·OH-含量增加而對細胞膜產(chǎn)生傷害[17]。在對蘿卜幼苗進行低溫處理時，蘿卜幼苗的POD活性先上升再下降再上升；蘿卜幼苗的SOD活性先下降再上升，而無論是POD還是SOD的活性總體上都比常溫條件下的要低。經(jīng)過不同濃度的Ca2+處理后的蘿卜幼苗葉片中的POD活性比只進行低溫處理的蘿卜幼苗葉片中的POD活性要低，在處理的第1天，用5 mmol/L Ca2+處理后的蘿卜幼苗POD活性下降得最少。在處理的第1天利用5 mmol/L Ca2+處理后的蘿卜幼苗SOD活性比只進行低溫處理的蘿卜幼苗SOD活性要高，且處理的第4、5天15、10 mmol/L Ca2+處理蘿卜幼苗葉片中SOD活性分別達到峰值。

3.2 Ca2+對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標影響的機制探究

低溫對植物組織的傷害大致分為兩個步驟：第一步為膜相的改變，膜從液晶態(tài)轉變?yōu)槟z態(tài)，使膜透性劇增；第二步是由于膜損壞而引起代謝紊亂，導致死亡。脂肪酸能直接提高膜的流動性，也能直接影響膜結合酶的活性。在低溫脅迫下，MDA、可溶性糖和Pro含量都有明顯變化[17]。此外，植物的抗寒性與活性氧代謝關系密切，低溫脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的H2O2、O■■·、·OH-等活性氧自由基，這些活性氧可導致膜脂過氧化，進而造成膜系統(tǒng)的氧化損傷[18]。而植物體內(nèi)存在著一系列酶促和非酶促的抗氧化劑以清除活性氧自由基，保護植物細胞免受活性氧的傷害，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以增強植株的抗寒力。SOD、POD等被認為是清除活性氧過程中最主要的抗氧化酶類，SOD的主要功能是清除O■■·并產(chǎn)生H2O2，而POD可以清除體內(nèi)的H2O2，二者協(xié)作及時清除自由基，有利于維持植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗低溫脅迫[19]。

施用外源Ca2+能減少植物體內(nèi)有害物質的積累，增加有利物質的合成，提高細胞膜的保護功能，抑制活性氧在植物體內(nèi)積累，大大提高生物對不良環(huán)境的抵抗力，提高植物的抗逆性。對于其機制目前有以下幾點猜測：①冷馴化中先啟動Ca2+信使，再通過調(diào)節(jié)蛋白質磷酸化而誘導與冷相關的基因表達，因而細胞的抗冷性增強；②鈣信號通過激活CDPK而活化脅迫誘導的啟動子，從而調(diào)控相應基因表達；③鈣信號通過調(diào)節(jié)一些蛋白質或酶活性而引發(fā)有利于植物適應逆境的生理生化反應，如激活CDPK而調(diào)節(jié)蛋白磷酸化、通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性提高植物的抗氧化性、調(diào)節(jié)氣孔啟閉、促進相溶性物質脯氨酸合成、參與離子的選擇吸收，以及參與ABA的信號轉導和植物的交叉保護等[20]。Ca2+不僅是大量營養(yǎng)元素，而且是重要的第二信使，調(diào)控植物生長發(fā)育的很多過程如光形態(tài)建成、向地性、細胞分化等。同時質膜的透性和穩(wěn)定性也與Ca2+有密切關系。

植物對逆境信號的感受是通過多條信號通路完成的，包括鈣信號轉導通路、ABA信號轉導通路、MAPK級聯(lián)信號通路等，各條通路之間相互交叉、相互影響，共同完成植物對逆境的適應[21]。其中，鈣信號被認為是各個級聯(lián)信號途徑中的交叉節(jié)點，而這個網(wǎng)絡中有很多過程還沒有被闡明。但是隨著分子生物學、遺傳學等學科的發(fā)展和新技術的產(chǎn)生，人們一定會對鈣信號的作用進行更深入的研究。

利用CaCl2處理的蘿卜幼苗雖未避免低溫脅迫引起的傷害，但程度已明顯減輕，這反映出適當濃度的鈣具有增強植物對低溫脅迫耐受性的生理作用。但是通過本試驗所測得的試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，這種耐受性加強作用只是在一定的時間范圍內(nèi)的，且利用Ca2+處理對不同的逆境指標的影響不同。例如處理后可溶性糖和MDA含量在一定時間范圍內(nèi)有所下降，而Pro的含量卻比只進行低溫處理的含量要高，這都在一定程度上降低了低溫脅迫對植物的傷害。

研究結果表明，在低溫脅迫下，蘿卜幼苗的可溶性糖、MDA以及Pro的含量明顯上升，POD和SOD活性先下降再上升。低溫脅迫下，用10 mmol/L CaCl2處理蘿卜幼苗后的第3天，可減少可溶性糖、膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累，但用CaCl2處理后蘿卜幼苗Pro的積累增加。當用10 mmol/L的CaCl2和完全培養(yǎng)液處理蘿卜幼苗后的第3天，SOD活性開始明顯上升，而在處理后的第1天和第2天，蘿卜幼苗的POD活性比只進行低溫處理的要低。這說明適當濃度的Ca2+處理能誘導蘿卜幼苗對低溫脅迫產(chǎn)生抗性，減輕低溫對蘿卜幼苗的傷害。

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