FoxA3和Hnf4α對原代大鼠肝細胞體外增殖的促進效應

摘要：為研究FoxA3和Hnf4α組合對原代大鼠肝細胞體外增殖的作用，構建了FoxA3和Hnf4α基因的慢病毒載體，共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞；倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞是否增殖；反轉(zhuǎn)錄PCR （Reverse transcription PCR，RT-PCR） 檢測外源基因和肝細胞特異基因的表達情況；PAS（Periodic acid-schiff）染色和吲哚菁綠（Indocyanine green，ICG）攝取檢測轉(zhuǎn)染細胞功能。結(jié)果表明，慢病毒轉(zhuǎn)染4 d后表達綠色熒光蛋白的部分肝細胞呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)并增殖成簇，與正常培養(yǎng)的肝細胞相比增殖能力明顯增強；PCR分析表明增殖的肝細胞除表達外源FoxA3和Hnf4α外，還表達肝細胞的標志基因Alb、CK18和G6p；功能檢測結(jié)果表明增殖的肝細胞具有成熟肝細胞糖原合成和吲哚菁綠攝取的能力。以上結(jié)果表明，F(xiàn)oxA3和Hnf4α能促使體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞進行增殖，并維持肝細胞的基本生物學特性。

關鍵詞：FoxA3；Hnf4α；大鼠肝細胞；細胞增殖

中圖分類號：Q253 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1648-04

肝細胞占總肝量的70%～80%，具有合成血清蛋白、酶和輔酶因子，儲存糖原和維生素，以及參與藥物和外源物質(zhì)代謝等功能，是肝臟生理功能的主要執(zhí)行者[1]。在體外，肝細胞可廣泛應用于基礎研究、藥物研發(fā)、生物人工肝及細胞治療的研究與臨床中[2]。因此對功能完善的肝細胞有較高的需求，盡管原代肝細胞具有較完整的肝細胞功能，但體外培養(yǎng)中難以增殖和長期維持肝細胞的功能[3]。提高肝細胞體外增殖能力是解決肝細胞來源匱乏的一個重要方向，目前實現(xiàn)肝細胞體外增殖的策略有：①在培養(yǎng)基中添加生長因子、激素或化學物質(zhì)[3-5]；②使用特殊的基質(zhì)或者肝細胞和其他細胞共培養(yǎng)[6-9]； ③肝細胞轉(zhuǎn)染外源基因?qū)崿F(xiàn)永生化[10]。前兩種策略能較好地維持肝細胞的特異基因表達和功能，但細胞體外增殖能力有限；肝細胞永生化能使體外培養(yǎng)的肝細胞獲得無限增殖的能力，主要策略有猴腎病毒40大T抗原（Simian virus 40 large T antigen，SV40T）[11]和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Telomerase reverse transcriptase，TERT）[12]基因介導的永生化。

2011年Sekiya等[13]將肝細胞核因子組合Foxa3和Hnf4α導入小鼠成纖維細胞中，獲得具有體外增殖能力的肝樣細胞，這表明FoxA3和Hnf4α可能對肝細胞體外增殖有促進作用。因此本研究旨在探討FoxA3和Hnf4α是否能促進體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞增殖，以期建立一種基于肝細胞特異基因作用的永生化肝細胞系，為肝細胞永生化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試驗動物和主要試劑

人HEK293T細胞、HEK293細胞、慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP（以下簡稱pCDH） 質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pCMVΔ8.91和pVSV-G均為本實驗室保存；pUC57-FoxA3和pUC57-Hnf4α質(zhì)粒及所有引物均合成于生工生物工程有限公司；XbaI、EcoRI、質(zhì)粒小量提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification、DNA切膠回收試劑盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、PrimeSTARTM HS DNA polymerase、T4 DNA連接酶、Taq DNA polymerase均購自寶生物工程（大連）有限公司；EGTA、CaCl2、BES、Trizol均購自上海鼎國生物工程有限公司；Sprague-Dawley（SD）大鼠由河南師范大學動物中心提供，原代大鼠肝細胞從SD大鼠肝臟中分離；膠原酶、肝細胞培養(yǎng)添加劑Insulin、Transferrin，Selenium Solution（ITS-G）100×、DMEM（高糖）培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；Reverse Transcription System購自Promega公司；糖原PAS過碘酸雪夫染色試劑盒和吲哚菁綠分別購自森貝伽公司和aladdin公司。

1.2 載體構建與鑒定

根據(jù)大鼠FoxA3（Gene ID：402691995），-Hnf4α（Gene ID：400153985，NM 022180.2）基因序列，使用Premier 5.0設計包含XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點（加粗）的FoxA3和Hnf4α引物。引物序列為：FoxA3上游引物：5′-TGCTCTAGAATGCTGGGCTCAGTG-3′；FoxA3下游引物：5′-GGCCTTAAGGGATCCTACGTAAC-3′；Hnf4α上游引物：5′-TGCTCTA-GAATGGACATGGCTGAC-3′；Hnf4α下游引物：5′-GGCCTTAAGGGATCTACCGAAGG-3′。分別以pUC57-FoxA3和pUC57-Hnf4α為模板，PCR擴增FoxA3和Hnf4α，XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切后的目的片段分別插入pCDH質(zhì)粒中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)大腸桿菌，對長出的克隆進行雙酶切鑒定。

1.3 細胞培養(yǎng)

人HEK293細胞和HEK293T細胞培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)基中，內(nèi)含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于5% CO2、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細胞生長至80%～90% 匯合度時進行傳代。大鼠原代肝細胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清、1% ITS-G和1% 青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。

1.4 重組慢病毒包裝、濃縮及滴度測定

采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法包裝病毒：轉(zhuǎn)染前1 d接種1×106個293T細胞于75 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞匯合度達50%～60%時進行轉(zhuǎn)染。取20 μg目的質(zhì)粒（pCDH-FoxA3或pCDH-Hnf4α）和10 μg pCMVΔ8.91、10 μg pVSV-G用無菌雙蒸水調(diào)至450 μL，加入50 μL的2.5 mol/L CaCl2，混勻后加入500 μL的2×BES緩沖鹽溶液充分混勻，室溫放置20 min后緩慢加到培養(yǎng)293T細胞的培養(yǎng)瓶中。14～16 h后換液，48和72 h后收集含病毒的上清液，0.45 μm濾膜過濾，4 ℃、6 000 r/min低速離心16 h，得到濃縮的病毒顆粒[14]，分裝后-80 °C保存。病毒液按照10倍倍比稀釋后感染293細胞，2 d后觀察熒光表達情況，細胞計數(shù)計算病毒滴度。

1.5 原代大鼠肝細胞的分離、培養(yǎng)及感染

采用Seglen等[15]的兩步膠原酶灌流法分離大鼠肝細胞：①門靜脈灌注含EGTA的D-Hanks液；②換用含0.05%膠原酶Ⅳ的Hanks液灌注。制成細胞懸液，臺盼藍排斥試驗測定細胞存活率并計數(shù)，調(diào)整細胞密度接種于鋪有鼠尾膠原的6孔板中培養(yǎng)，4 h后換液去除沒有貼壁的細胞和死細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h用于轉(zhuǎn)染。稀釋FoxA3和Hnf4α病毒液，以10 MOI （multiplicity of infection）的病毒數(shù)量加入同一個肝細胞培養(yǎng)孔中，6～12 h后換液以去除病毒液。培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達率、細胞形態(tài)和增殖情況。肝細胞感染病毒后每3 d換液1次。

1.6 PCR檢測

大鼠肝細胞感染慢病毒7 d后，按照TIANGEN的基因組提取說明書提取感染細胞和正常大鼠肝細胞的基因組，PCR擴增exo FoxA3和exo Hnf4α；采用Trizol法抽提感染細胞和正常大鼠肝細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進行PCR擴增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因作為內(nèi)參檢測肝細胞特異基因Alb、CK18和G6p的表達情況。PCR反應條件：94 °C預變性3 min； 94 °C變性30 s，退火（溫度見表1）45 s，72 °C延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相并觀察。PCR引物見表1。

1.7 PAS反應檢測

大鼠肝細胞感染慢病毒14 d后，取感染肝細胞進行細胞涂片，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗；過碘酸水溶液作用10 min，水洗；Schiff試劑避光反應10 min，水洗；蘇木素染色1～2 min，水洗；分化液分化1～2 min，水洗后倒置相差顯微鏡下觀察并照相。

1.8 ICG攝取檢測

大鼠肝細胞感染慢病毒14 d后，取感染肝細胞吸棄培養(yǎng)基，加入含1 mg/mL ICG的肝細胞培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS洗3次，加入肝細胞培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡下觀察細胞顏色并照相，攝取ICG的細胞呈現(xiàn)綠色。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組慢病毒載體的鑒定和滴度測定

構建的重組慢病毒載體pCDH-FoxA3和pCDH-Hnf4α經(jīng)XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后分別獲得1 065 bp（FoxA3）和1 398 bp（Hnf4α）的片段（圖1），與預期結(jié)果相符，表明構建的重組慢病毒載體是正確的。經(jīng)計算濃縮后的FoxA3和Hnf4α慢病毒滴度分別為6×107 TU/mL和7.5×107 TU/mL。

2.2 重組慢病毒感染肝細胞

在含F(xiàn)oxA3和Hnf4α基因的慢病毒感染原代肝細胞4 d后，觀察到表達綠色熒光蛋白的細胞中有些增殖成簇，有些迅速凋亡。與原代肝細胞相比，增殖細胞形態(tài)呈多角的上皮樣、體積變小，有較強的增殖能力。增殖的肝細胞在長期體外培養(yǎng)中維持穩(wěn)定的形態(tài)和較高的增殖速率（圖2）。

2.3 增殖肝細胞的PCR檢測

檢測增殖肝細胞中外源基因的表達情況：分別以增殖肝細胞的基因組和mRNA作為模板，以質(zhì)粒作為陽性對照進行PCR擴增，結(jié)果表明外源基因FoxA3和Hnf4α整合到增殖肝細胞的基因組中，并能正確表達（圖3A）。RT-PCR檢測增殖細胞的肝細胞標志基因的表達情況，結(jié)果顯示增殖的肝細胞表達肝細胞標志基因Alb、CK18和G6p，GAPDH為內(nèi)參（圖3B）。

2.4 增殖肝細胞功能檢測

PAS染色后顯微鏡下可見增殖肝細胞呈紫紅色陽性反應，同時ICG攝取試驗表明增殖肝細胞有攝取ICG的能力（圖4）。

3 討論

目前生物人工肝和肝細胞移植作為原位肝移植的替代方案，在肝臟疾病臨床治療中取得了一定的效果。肝細胞體外難以增殖且部分功能會逐漸喪失，在數(shù)量和質(zhì)量上遠不能滿足臨床需要，因此研究肝細胞體外增殖有著十分重要的現(xiàn)實意義。FoxA3是起始肝臟發(fā)育的“先鋒因子”、能調(diào)節(jié)肝特異基因表達和維持血糖平衡[16-18]；Hnf4α參與哺乳動物肝臟發(fā)育過程中肝細胞的分化和形態(tài)形成，而且對于成體肝臟的代謝調(diào)節(jié)和功能維持是必需的[19，20]。研究表明FoxA3和Hnf4α還能調(diào)控終末分化細胞向肝樣細胞的轉(zhuǎn)分化，F(xiàn)oxa1+Hnf4α、Foxa2+Hnf4α、Foxa3+Hnf4α、Gata4+Hnf1α+Foxa3組合均能使小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肝樣細胞[13，21]；FOXA3 +HNF1A+HNF4A組合還能誘導人成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肝樣細胞[22]。然而FoxA3和Hnf4α對肝細胞體外增殖的作用研究還未見報道。因此本研究通過構建pCDH-FoxA3和pCDH-Hnf4α重組慢病毒載體并共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細胞，從而探究FoxA3和Hnf4α組合對原代大鼠肝細胞體外增殖的作用。

結(jié)果表明，肝細胞感染FoxA3和Hnf4α慢病毒后增殖能力明顯增強，外源基因FoxA3和Hnf4α整合到增殖的肝細胞基因組中并表達，外源基因沒有被沉默，這與Sekiya等[13]的研究結(jié)果一致。RT-PCR結(jié)果還顯示增殖的肝細胞表達肝細胞特異基因Alb、CK18、G6p。PAS染色和ICG攝取結(jié)果表明增殖肝細胞維持了肝細胞糖原合成和吲哚菁綠攝取的功能。以上結(jié)果證實了FoxA3和Hnf4α對原代大鼠肝細胞體外增殖的促進效應，并且維持肝細胞的基本生物學特征。為進一步研究肝細胞增殖的調(diào)控機制提供了試驗基礎，也為肝細胞永生化提供了新思路。與其他來源的肝樣細胞相比，本試驗獲得的增殖肝細胞也許能避免表觀遺傳記憶。而FoxA3和Hnf4α促進肝細胞體外增殖的機制還需要進一步研究。

參考文獻：

[1] TAUB R. Liver regeneration： from myth to mechanism [J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2004， 5（10）： 836-847.

[2] LI A P. Human hepatocytes： Isolation， cryopreservation and applications in drug development[J]. Chemico-biological Interactions， 2007， 168（1）： 16-29.

[3] BLOCK G D， LOCKER J， BOWEN W C， et al. Population expansion， clonal growth， and specific differentiation patterns in primary cultures of hepatocytes induced by HGF/SF， EGF and TGF alpha in a chemically defined （HGM） medium[J]. J Cell Biol， 1996， 132（6）： 1133-1149.

[4] MITAKA T. The current status of primary hepatocyte culture[J]. International Journal of Experimental Pathology， 1998， 79（6）： 393-409.

[5] MCGOWAN J A， STRAIN A J， Bucher N L. DNA synthesis in primary cultures of adult rat hepatocytes in a defined medium： Effects of epidermal growth factor， insulin， glucagon， and cyclic-AMP[J]. Journal of Cellular Physiology， 1981， 108（3）： 353-363.

[6] BERTHIAUME F， MOGHE P V， TONER M， et al. Effect of extracellular matrix topology on cell structure， function， and physiological responsiveness： Hepatocytes cultured in a sandwich configuration[J]. The FASEB Journal， 1996， 10（13）： 1471-1484.

[7] TAN G D S， TOH G W， BIRGERSSON E， et al. A thin-walled polydimethylsiloxane bioreactor for high-density hepatocyte sandwich culture[J]. Biotechnology and Bioengineering， 2013， 110（6）： 1663-1673.

[8] TAKASHI H， KATSUMI M， TOSHIHIRO A. Hepatocytes maintain their function on basement membrane formed by epithelial cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2007， 359（1）： 151-156.

[9] CHO C H， BERTHIAUME F， TILLES A W， et al. A new technique for primary hepatocyte expansion in vitro[J]. Biotechnology and Bioengineering， 2008， 101（2）： 345-356.

[10] CASCIO S M. Novel strategies for immortalization of human hepatocytes[J]. Artificial Organs， 2001， 25（7）： 529-538.

[11] PAUL D， HOHNE M， PINKERT C， et al. Immortalized differentiated hepatocyte lines derived from transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes [J]. Exp Cell Res， 1988， 175（2）：354-362.

[12] WEGE H， LE H T， CHUI M S， et al. Telomerase reconstitution immortalizes human fetal hepatocytes without disrupting their differentiation potential [J]. Gastroenterology， 2003， 124（2）：432-444.

[13] SEKIYA S， SUZUKI A. Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors [J]. Nature， 2011， 475（7356）： 390-393.

[14] BOWLES N E， EISENSMITH R C， MOHUIDDIN R， et al. A simple and efficient method for the concentration and purification of recombinant retrovirus for increased hepatocyte transduction in vivo[J]. Human Gene Therapy，1996，7（14）： 1735-1742.

[15] SEGLEN P O. Preparation of isolated rat liver cells [J]. Methods Cell Biol， 1976， 13（1）： 29-83.

[16] CIRILLO L A， LIN F R， CUESTA I， et al. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3（FoxA） and GATA-4 [J]. Molecular Cell， 2002， 9（2）：279-289.

[17] KAESTNER K H， HIEMISCH H， SCH？譈TZ G. Targeted disruption of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 3γ results in reduced transcription of hepatocyte-specific genes [J]. Molecular and Cellular Biology，1998，18（7）：4245-4251.

[18] SHEN W， SCEARCE L M， BRESTELLI J E， et al. Foxa3 （hepatocyte nuclear factor 3γ） is required for the regulation of hepatic GLUT2 expression and the maintenance of glucose homeostasis during a prolonged fast[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276（46）：42812-42817.

[19] LI J， NING G， DUNCAN S A. Mammalian hepatocyte differentiation requires the transcription factor HNF-4α [J]. Genes Development， 2000， 14（4）： 464-474.

[20] KLOCKE R， JOS？魪GMEZ-LECH？魷N M， EHRHARDT A， et al. Establishment and characterization of immortal hepatocytes derived from various transgenic mouse lines [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2002， 294（4）： 864-871.

[21] HUANG P， HE Z， JI S， et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors [J]. Nature， 2011， 475（7356）： 386-389.

[22] HUANG P， ZHANG L， GAO Y， et al. Direct reprogramming of human fibroblasts to functional and expandable hepatocytes [J]. Cell Stem Cell， 2014， 14（3）： 370-384.