銀杏MECT基因啟動(dòng)子克隆及序列分析

摘要：以前期獲得的銀杏（Ginkgo biloba L.）MECT基因的cDNA序列為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物及采用染色體步移的方法從銀杏基因組中克隆到GbMECT翻譯起始位點(diǎn)上游982 bp的啟動(dòng)子序列，研究銀杏MECT基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該啟動(dòng)子序列中含有多種類型的順式作用元件，主要有典型的光響應(yīng)調(diào)節(jié)元件、激素響應(yīng)調(diào)控元件、抗病蟲害響應(yīng)元件TGTCA序列、抗損傷應(yīng)答元件ERF3和熱激響應(yīng)元件HSE等。此外，在該啟動(dòng)子片段中還含有氧脅迫和銅離子響應(yīng)元件、淀粉酶響應(yīng)元件等其他類型的作用元件，充分體現(xiàn)了啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)調(diào)控具有轉(zhuǎn)錄水平上的高效性和復(fù)雜性的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：銀杏（Ginkgo biloba L.）；染色體步移；2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶基因；調(diào)控元件

中圖分類號(hào)：S792.95 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1746-05

在銀杏（Ginkgo biloba L.）萜內(nèi)酯合成的MEP途徑中，MECT （2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate Cytidyltransferase，MEP cytidyltransferase）是其第三步反應(yīng)的催化酶，催化2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-ohosphate， MEP）形成4-（胞苷5-焦磷酸）-2C-甲基赤蘚糖[4-（cytidine 5-diphospho）-2C-methyl-D-erythritol，CDP-ME]，并最終形成合成萜內(nèi)酯的前體物質(zhì)，因此MECT是調(diào)控萜類物質(zhì)合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。目前，已經(jīng)從銀杏（Ginkgo biloba.L）[1]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[2]、玉米（Zea mays）[3]、番茄（Lycopersicon esculentum）[4]、水稻（Oryza sativa）[5]、大豆（Glycine max）[6]、火炬松（Pinus taeda）[7]等多種植物中克隆了MECT基因。

研究發(fā)現(xiàn)，在DNA水平上，銀杏MECT基因與擬南芥和水稻MECT基因相似度分別達(dá)到了70.7%和70.2%。盡管已從多種植物中獲得MECT基因的cDNA序列，但目前關(guān)于該基因啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控方面的研究報(bào)道較少，尤其缺乏對(duì)該基因啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)和功能分析方面的探究，本試驗(yàn)通過(guò)染色體步移法克隆銀杏MECT基因的啟動(dòng)子，初步分析該啟動(dòng)子所含的調(diào)節(jié)元件和作用特點(diǎn)，旨在為啟動(dòng)子下一步的功能分析提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

銀杏幼葉采自黃岡師范學(xué)院銀杏苗圃園，品種為家佛手14年生實(shí)生苗。采后自封袋封裝，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。試驗(yàn)所用大腸桿菌（Escherichia coli）菌株Top10為經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

各種限制性內(nèi)切酶、ExTaq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物克隆載體pMD18-T Vector、dNTP、DL2000、T4 DNA Polymerase和T4 DNA Ligase均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。各種寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 銀杏DNA提取 采用改良的CTAB法[8]大量提取銀杏基因組DNA。

1.3.2 基因組酶切與連接 用平末端限制酶EcoRⅤ、DraⅠ、SspⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、HpaⅠ、ScaⅠ和SmaⅠ分別進(jìn)行單酶切，37 ℃酶切過(guò)夜（8 h），各取5 μL用0.8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)是否酶切完全，酶切產(chǎn)物分別純化回收；回收后與各自的接頭連接，體積為50 μL。連接反應(yīng)體系為DNA酶切產(chǎn)物（模板）30 μL、T4 DNA Ligase Buffer （10×） 5 μL、接連體10 μL、T4 DNA Ligase 3 μL、ddH2O 2 μL，反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃連接12 h。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)及染色體步移擴(kuò)增 根據(jù)Genebank提交的銀杏MECT基因cDNA序列（登錄號(hào)DQ102360）分別設(shè)計(jì)引物MT1、MT2（表1），與2個(gè)接頭引物AP1、AP2形成巢式引物，進(jìn)行第一次步移擴(kuò)增。將得到的目的片段連接到pMD18-T載體上，送出測(cè)序。根據(jù)第一次擴(kuò)增的啟動(dòng)子序列，繼續(xù)設(shè)計(jì)引物MT3、MT4（表1）進(jìn)行了第二次步移并測(cè)序。

1.3.4 目的片段回收、片段與載體連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序 根據(jù)瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，采用膠回收試劑盒回收所需的目的片段。所用的T載體為pMD18-T Vector，之后與回收片段連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行鑒定和篩選，將含有目的基因重組子的菌株送去測(cè)序。

1.3.5 生物信息學(xué)分析 用DNAMAN等生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行處理，然后將測(cè)序獲得的啟動(dòng)子序列提交至PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）進(jìn)行在線分析，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列保守區(qū)域中潛在的順式作用元件。通過(guò)McPromote在線工具預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏MECT基因啟動(dòng)子序列克隆及驗(yàn)證

將銀杏基因組用8個(gè)平末端限制性內(nèi)切酶（EcoRⅤ、DraⅠ、SspⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、HpaⅠ、ScaⅠ和SmaⅠ）分別進(jìn)行消化，酶切產(chǎn)物加上接頭后作為模板與其特異性引物進(jìn)行步移擴(kuò)增，經(jīng)2輪PCR后，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，在ScaⅠ的酶切體系中得到了500 bp左右的PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物回收并測(cè)序。在第一次步移得到的上游啟動(dòng)子序列（圖1A）的5′端設(shè)計(jì)兩個(gè)下游引物，繼續(xù)進(jìn)行第二次步移擴(kuò)增，圖1B即為第二次擴(kuò)增結(jié)果。將2次步移的產(chǎn)物在Vector NTI軟件中進(jìn)行序列拼接比對(duì)，得到了長(zhǎng)982 bp的目的片段，通過(guò)分析比較證實(shí)該片段3′端序列與MECT基因cDNA序列的5′端部分片段重合一致，說(shuō)明獲得的序列為銀杏MECT基因上游啟動(dòng)子的部分片段。

2.2 銀杏MECT基因啟動(dòng)子區(qū)域序列的生物信息學(xué)分析

銀杏MECT基因啟動(dòng)子序列如圖2所示，通過(guò)McPromote預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能為位于982 bp處的堿基A，將此位點(diǎn)標(biāo)記為+1。TATA-box位于上游-106 bp處，CAAT-box位于-150 bp處，該啟動(dòng)子序列上含有多種對(duì)光照、干旱、傷害、金屬離子和細(xì)胞周期誘導(dǎo)響應(yīng)的啟動(dòng)子元件，也含有一些組織特異性啟動(dòng)子元件，依據(jù)PLACE database （http：//www. dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析結(jié)果已將部分作用元件在圖示中做了標(biāo)記。

2.2.1 光調(diào)控元件 分析發(fā)現(xiàn)銀杏MECT啟動(dòng)子序列含有多個(gè)與光調(diào)節(jié)相關(guān)的調(diào)控元件，如GATA-box （GATA）、GT-1（GRWAAW）等，GT-1存在于許多光調(diào)節(jié)基因中，是GT-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守位點(diǎn)；另有Inr element（YTCANTYY）、ASF1（TGACG）及I-box（GATAA）等均是與光響應(yīng)有關(guān)的順式元件（表2）。

2.2.2 抗逆境脅迫及與激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件 從預(yù)測(cè)結(jié)果分析來(lái)看，有些啟動(dòng)子元件既能響應(yīng)逆境脅迫同時(shí)也與激素調(diào)節(jié)有關(guān)，說(shuō)明逆境脅迫與激素調(diào)節(jié)存在一定的交叉作用，兩者互相關(guān)聯(lián)，體現(xiàn)了啟動(dòng)子作用元件之間的互作性和復(fù)雜性。表3中有大量響應(yīng)激素調(diào)節(jié)的順式元件，與細(xì)胞分裂素相關(guān)的ARR1（NGATT）8個(gè)，CPBCSPOR（TATTAG）3個(gè)，是依賴細(xì)胞分裂素的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；與脫落酸響應(yīng)相關(guān)的元件有MYC（CANNTG）和MYB1AT（WAACCA）2種，其中MYC元件有6個(gè)；該序列中響應(yīng)赤霉素的順式元件較多，其中WRKY（TGAC）是一種赤霉素信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄抑制子，此類型的調(diào)節(jié)元件共6個(gè)，此外還有TATCCA序列、CAREs （CAACTC）、GARE（TAACAGA）和GA（TAACAAR）；另有2種與生長(zhǎng)素作用相關(guān)的元件ASF-1 （TGACG）、CATATG序列；與乙烯作用相關(guān)的元件僅有1種ACS（TAAAATAT）。響應(yīng)逆境脅迫的元件有：抗病蟲害響應(yīng)元件TGTCA、抗損傷元件ERF3 （TGACY）、熱激響應(yīng)元件HSE（CCAAT）及防衛(wèi)基因的誘導(dǎo)元件W-box（CTGACY）。

2.2.3 其他類型調(diào)控元件 除對(duì)光、激素及逆境脅迫相關(guān)的元件外，銀杏MECT啟動(dòng)子序列中還存在以下特異性元件：根組織特異性元件rolD（ATATT）、與苯丙氨酸和木質(zhì)素代謝相關(guān)的元件MYBPLANT（MACCWAMC）、受糖抑制作用的元件SRE（TTATCC）、氧脅迫和銅離子響應(yīng)元件CuRE（GTAC）、淀粉酶響應(yīng)元件amylase-box（TATCCAT） 等，詳見表4。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，采用染色體步移的方法克隆了MECT基因翻譯起始位點(diǎn)上游982 bp的啟動(dòng)子序列，對(duì)其調(diào)控區(qū)域進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果表明，銀杏MECT基因啟動(dòng)子中含有光響應(yīng)元件GATA-box（GATA）、GT-1（GRWAAW）及I-box（GATAA）等，其中GATA-box（GATA）是捕光葉綠素a/b蛋白復(fù)合體基因（cab）中大量存在的光應(yīng)答元件，cab即是典型的光依賴型基因。通常GATA-box（GATA）作為一種光開關(guān)（Light switches）存在于植物基因啟動(dòng)子中。GT-1 （GRWAAW）存在于某些光誘導(dǎo)啟動(dòng)子中，但也可在不顯示光效應(yīng)的啟動(dòng)子中存在，并且在某些光誘導(dǎo)啟動(dòng)子中，GT-1 缺失也不會(huì)完全喪失光調(diào)節(jié)特性。因此，GT-1在光調(diào)節(jié)表達(dá)中可能不是必需的。I-box是光調(diào)節(jié)所必需的調(diào)控元件，若缺失或突變都會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子光誘導(dǎo)能力下降，在水稻Osrbcs[9]、番茄PSY[10]、豌豆rbcS[11]等基因啟動(dòng)子中都存在。

在銀杏MECT基因啟動(dòng)子中還含有各種激素響應(yīng)元件，與細(xì)胞分裂素相關(guān)的ARR1（NGATT）元件在作用過(guò)程中能與轉(zhuǎn)錄因子ARR1結(jié)合，是植物對(duì)細(xì)胞分裂素的應(yīng)答調(diào)節(jié)因子[12]。脫落酸響應(yīng)相關(guān)的元件MYC（CANNTG）、MYB1AT（WAACCA）也與逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)，推測(cè)當(dāng)植物處于脫水、干旱等逆境脅迫條件時(shí)，MYB、MYC可作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，以某種方式促進(jìn)脫落酸等植物內(nèi)源激素合成，通過(guò)落葉、促進(jìn)休眠等方式減少養(yǎng)分和水分消耗，以起到抗脅迫作用，維持植物正常生命活動(dòng)。由此發(fā)現(xiàn)，許多響應(yīng)逆境脅迫的元件同時(shí)也是某些激素的響應(yīng)元件，如ASF-1（TGACG）既是生長(zhǎng)素的應(yīng)答元件同時(shí)也是一種抗病害的響應(yīng)元件。該啟動(dòng)子中還含有熱激響應(yīng)元件HSE（CCAAT），這類熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子對(duì)刺激產(chǎn)生響應(yīng)的延遲時(shí)間短、活性強(qiáng)，一般能快速對(duì)高溫脅迫作出反應(yīng)[13]。

由序列分析的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，在銀杏MECT基因啟動(dòng)子序列中含有許多重要的順式作用元件。通過(guò)分析各種類型元件的作用特點(diǎn)，可以了解影響其作用的因素，從而對(duì)萜內(nèi)酯合成的影響因素做出初步判定，為后面啟動(dòng)子的功能分析提供有效信息。

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