維生素E對(duì)毒死蜱脅迫下斑馬魚血清CAT和SOD的保護(hù)作用

（湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100）

摘要：通過對(duì)斑馬魚肌肉注射不同濃度毒死蜱以及維生素E，研究斑馬魚血清中過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活力變化情況以及維生素E的抗氧化作用。試驗(yàn)分為5組，依次為對(duì)照組和低、中、高濃度毒死蜱組（0.002、0.02、0.2 mg/kg）以及高濃度聯(lián)合維生素E（0.2 mg/kg+VE）治療組。結(jié)果表明，毒死蜱不同濃度組短時(shí)間（24 h）作用均使兩種酶活性升高（P﹤0.01），加維生素E組活性增高更顯著；長時(shí)間（168 h）作用則明顯抑制酶活性（P﹤0.01），維生素E組酶活性變化較平緩。表明毒死蜱對(duì)斑馬魚機(jī)體抗氧化系統(tǒng)損傷作用明顯，維生素E對(duì)CAT和SOD活力有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：維生素E；毒死蜱；斑馬魚；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶

中圖分類號(hào)：X592 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1590-03

毒死蜱（Chlorpyrifos）商品名為樂斯本，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，憑借其高效、低毒、廣譜的特性成為全球應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥之一[1]。毒死蜱主要通過干擾膽堿酯酶的活性，從而影響人類和昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]。毒死蜱類有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較低，但對(duì)水生魚類的毒性卻比較高，若使用不當(dāng)進(jìn)入水環(huán)境，將對(duì)水生生態(tài)和水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來比較大的危害[3]。由于毒死蜱的大量使用，在較多地區(qū)的土壤、大氣、雨水和地下水等均能檢測(cè)到毒死蜱殘留，水體也由于毒死蜱污染累積導(dǎo)致魚類死亡。農(nóng)藥對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的危害最終會(huì)通過富集濃縮和食物鏈傳遞給人類[4]。因此，研究毒死蜱的毒理作用將可為農(nóng)藥安全使用，水產(chǎn)資源和生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供理論依據(jù)。

外源毒物通過各種途徑進(jìn)入生物機(jī)體后，感染機(jī)體會(huì)出現(xiàn)各種生物標(biāo)記物的改變，這種生物標(biāo)記物常用來評(píng)估受試化學(xué)品對(duì)生物的生態(tài)毒理效應(yīng)[5]，過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）是生物標(biāo)記物中最典型的兩種酶。CAT和SOD是體內(nèi)清除自由基的抗氧化酶，它們之間通過協(xié)同作用能夠防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷[6]。環(huán)境污染物質(zhì)對(duì)水生生物會(huì)造成過氧化脅迫，使生物體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基[7]，SOD能催化歧化體內(nèi)超氧陰離子自由基為過氧化氫（H2O2），CAT催化H2O2分解為H2O和O2。通過CAT和SOD調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧自由基處于平衡的狀態(tài)，一旦機(jī)體受到毒理損傷，這種平衡就會(huì)被打破，因而CAT和SOD作為抗氧化防御系統(tǒng)的改變就能反映環(huán)境對(duì)機(jī)體的毒害作用。本試驗(yàn)研究了毒死蜱對(duì)斑馬魚血清中CAT和SOD的影響，以衡量農(nóng)藥對(duì)水產(chǎn)環(huán)境及水生生物的生態(tài)毒理指標(biāo)。

維生素E有許多生理功能，其中最重要的功能就是抗氧化。維生素E能有效防止機(jī)體脂質(zhì)過氧化及由于外因所致的氧化，保護(hù)細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)巰基，維持細(xì)胞膜的正常功能，尤其是保護(hù)亞細(xì)胞膜的完整性，避免受到過氧化物損害[8]。另外維生素E還能防治由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等[9]。本研究表明維生素E能夠有效保護(hù)CAT和SOD在斑馬魚血清中的活性，減輕毒死蜱對(duì)機(jī)體造成的過氧化脅迫。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，平均體長2～3 cm。試驗(yàn)前在室內(nèi)馴養(yǎng)7 d以上，自然死亡率小于2%，試驗(yàn)前1天停止喂食，試驗(yàn)期間每48 h定量喂食1次。

1.2 試劑與儀器

毒死蜱原藥（98%，安徽華星化工股份有限公司），用無菌生理鹽水配成不同濃度溶液待用。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器為UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（島津制作所）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和染毒 試驗(yàn)共分5組，分別為陰性對(duì)照組、低中高3個(gè)濃度梯度試驗(yàn)組和1個(gè)高濃度聯(lián)合維生素E組。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，以0.002、0.02、0.2 mg/kg劑量對(duì)斑馬魚進(jìn)行肌肉注射，每組25尾魚，每尾注射1 mL毒死蜱溶液，分別于容積10 L塑料箱中裝水飼養(yǎng)。維生素E劑量為100 mg/kg，稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用，使用時(shí)在旋渦混懸儀上充分混勻。試驗(yàn)用水為曝氣去氯處理24 h后的自來水，水溫17～20 ℃，pH為6.8～7.5，水中溶氧量保證5 mg/L以上。按預(yù)定時(shí)間段0、24、48、96、168 h時(shí)分別取魚采樣進(jìn)行分析，每組濃度每次取樣5尾。

1.3.2 取血采樣 采樣之前，先用1%肝素鈉處理注射器，于魚尾采血，直接放入干凈試管中以制備血清，對(duì)血清CAT和SOD活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 酶活力測(cè)定方法 CAT活性測(cè)定采用Góth[10]的方法，以H2O2為底物，經(jīng)CAT在37 ℃催化反應(yīng)1 min后，用鉬酸銨終止反應(yīng)，在25 ℃放置5 min，由于反應(yīng)后剩余的過氧化氫能與鉬酸銨形成穩(wěn)定的黃色復(fù)合物，其顏色的深淺與酶活力成反比，因此在405 nm處測(cè)量該黃色復(fù)合物的生成量，即可計(jì)算出CAT的活力。

SOD活性測(cè)定采用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化抑制法[11]。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，生成一系列有強(qiáng)烈光吸收的中間產(chǎn)物，并同時(shí)釋放出O2-，該反應(yīng)生成的中間產(chǎn)物在紫外320 nm處的光吸收值在最初5 min內(nèi)呈線性關(guān)系，而SOD是專以氧自由基為底物的金屬酶，在有質(zhì)子的介質(zhì)中，它能迅速將O2-歧化，產(chǎn)生O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物積累，據(jù)此原理可用來測(cè)定SOD的活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析（ANOVA），然后使用LSD檢驗(yàn)比較兩組間均數(shù)的差異性。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒死蜱對(duì)斑馬魚血清CAT的影響以及維生素E對(duì)CAT的保護(hù)作用

毒死蜱對(duì)斑馬魚血清CAT的影響如圖1所示。各濃度組在24 h時(shí)對(duì)CAT活性都有激活效應(yīng)，在48 h時(shí)達(dá)到最大（P﹤0.05），中濃度產(chǎn)生的激活效應(yīng)最明顯（P﹤0.01）。48 h后各濃度組CAT活性都有不同程度的下降（P﹤0.05），且都比24 h時(shí)活力低。168 h后，中高濃度組CAT活力基本喪失（P﹤0.01）。

維生素E對(duì)CAT活性的保護(hù)作用如圖1所示。在96 h時(shí)，加了維生素E組的CAT活性與高濃度組相比要高一些（P﹤0.05），168 h時(shí)高濃度組CAT活力基本喪失（P﹤0.01），而維生素E組CAT活性基本和96 h一樣，并且接近對(duì)照組。表明維生素E可以維持機(jī)體CAT活性為正常水平。

2.2 毒死蜱對(duì)斑馬魚血清SOD的影響以及維生素E對(duì)SOD的保護(hù)作用

毒死蜱對(duì)斑馬魚血清SOD的影響如圖2所示。同CAT活性變化相似，各濃度組在24 h時(shí)對(duì)SOD活性都有不同程度的激活作用（P﹤0.05），在48 h時(shí)達(dá)到最大（P﹤0.01），相比之下維生素E組產(chǎn)生的激活效應(yīng)最明顯（P﹤0.01）。48 h后各濃度組SOD活性都有不同程度的下降（P﹤0.05），且都比24 h時(shí)活力低，其中高濃度組下降程度最明顯（P﹤0.01）。

維生素E對(duì)SOD活性的保護(hù)作用如圖2所示。在96 h時(shí)，加了維生素E組的SOD活性與高濃度組相比酶活要高一些（P﹤0.05），168 h時(shí)高濃度組SOD活力喪失明顯，而維生素E組SOD活性維持較高水平（P﹤0.05），并且接近96 h。說明維生素E可以維持機(jī)體SOD活性。

3 小結(jié)與討論

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)的氧自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，此時(shí)氧自由基對(duì)機(jī)體是無害的。一旦氧自由基過量，超過了細(xì)胞抗氧化防護(hù)的能力，就會(huì)造成氧化脅迫，進(jìn)而影響機(jī)體正常生理活動(dòng)，容易引起癌癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化以及各種神經(jīng)退行性疾病[12]。毒死蜱同其他有機(jī)磷類農(nóng)藥一樣，會(huì)對(duì)生物體造成氧化脅迫，破壞氧自由基的代謝平衡，造成機(jī)體損傷[13]。機(jī)體內(nèi)部的各種組織和器官具有不同的代謝活力和耗氧量，它們抗氧化的能力也各不相同。農(nóng)藥對(duì)機(jī)體的傷害是漸進(jìn)式的，首先是在血液中沉積，通過血液流到機(jī)體各個(gè)器官，造成器官代謝障礙，進(jìn)而反饋影響血液中的代謝產(chǎn)物和合成產(chǎn)物發(fā)生紊亂[5]。所以，通過檢測(cè)血液中生物標(biāo)記物的改變，可以更直觀地觀察待檢樣品對(duì)機(jī)體過氧化損傷的情況。這種漸進(jìn)式的中毒機(jī)制也導(dǎo)致了不同注射濃度和作用時(shí)間對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性效應(yīng)出現(xiàn)差異。CAT和SOD是體內(nèi)清除自由基的主要抗氧化酶，它們的活性很容易被體內(nèi)氧化脅迫影響，所以檢測(cè)它們的酶活性就可以反映機(jī)體受到氧化損傷的程度。

在低濃度毒死蜱脅迫下，斑馬魚血清中的CAT活性顯著升高；隨著毒死蜱濃度的升高，酶活性又進(jìn)而降低，這種現(xiàn)象即為“毒物興奮效應(yīng)”[14]。由于在機(jī)體內(nèi)，CAT和SOD是協(xié)同作用清除氧自由基，因此對(duì)農(nóng)藥脅迫的反應(yīng)應(yīng)該有相似的結(jié)果，這與試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象一致，兩種酶的活性均先升高然后隨著作用時(shí)間的延長而逐漸降低。在高濃度（0.2 mg/kg）毒死蜱脅迫下，SOD活性升高幅度很小，幾乎沒有激活效應(yīng)，而是直接下降，說明當(dāng)受到重度逆境脅迫時(shí)，SOD活性一般會(huì)降低。

維生素E在消除過氧化物，防止脂質(zhì)過氧化方面作用顯著，能清除體內(nèi)的氧化應(yīng)激物對(duì)機(jī)體抗氧化酶系的氧化脅迫，從而保護(hù)抗氧化酶，使其活性維持正常。試驗(yàn)中也觀察到，維生素E對(duì)CAT和SOD有明顯的保護(hù)作用，在毒死蜱脅迫96 h以后，維生素E使CAT和SOD活性與高濃度組相比維持一個(gè)較高水平。維生素E對(duì)抗氧化酶的保護(hù)作用可能是通過降低過氧化脂質(zhì)水平，提高機(jī)體還原性谷胱甘肽含量，顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性，從而維持機(jī)體內(nèi)CAT和SOD的正常水平[15]。

本試驗(yàn)采用肌肉注射法施毒，具有劑量準(zhǔn)確、藥效迅速的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可避免體腔注射對(duì)魚體作用過于強(qiáng)烈和靜水投毒無法精確掌握魚體中毒量的缺陷。試驗(yàn)證明肌肉注射施毒可以作為毒理學(xué)研究的有效方法。本研究結(jié)果表明，毒死蜱對(duì)斑馬魚抗氧化系統(tǒng)有明顯損傷作用，在日常的使用中應(yīng)該注意施藥濃度，以免危害水資源和水生生物。對(duì)已經(jīng)遭到毒死蜱污染的生物可以嘗試用維生素E來減輕機(jī)體傷害。

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