基于Image J軟件的水稻根毛長度測量

摘要：以體視鏡拍攝的水稻（Oryza sativa）中旱5號（ZH5）和珍汕97（ZS97）的主根照片為研究對象，利用圖像分析軟件Image J建立了一種全新的水稻根毛長度測量方法。在不同的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件下，分別對位于水稻主根不同部位根毛的長度進(jìn)行統(tǒng)計，得到一組最優(yōu)的水稻根毛的測量方法和測量條件。用所建立的水稻根毛長度測量體系，對兩組肉眼觀察根毛長度無明顯差異的水稻品種進(jìn)行了測量，結(jié)果表明，此種方法可以檢測出兩個水稻品種間根毛長度的差異。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa）；根毛；長度測量；Image J軟件

中圖分類號：S511；TP391 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1722-04

水稻是單子葉植物的模式植物，也是重要的糧食作物。目前對于水稻地下部分的研究相對薄弱。根系是植物吸收外界水分、養(yǎng)分的主要器官，環(huán)境條件和栽培措施大多是首先通過影響根系的發(fā)育，進(jìn)而影響到植株地上部分的生長。根毛是根的成熟區(qū)表皮細(xì)胞的細(xì)長突起。大部分被子植物的表皮細(xì)胞分為生毛細(xì)胞（H細(xì)胞）和非生毛細(xì)胞（N細(xì)胞）。以前一直認(rèn)為水稻根毛是由表皮細(xì)胞不對稱分裂后形成小的子細(xì)胞分化產(chǎn)生的，但近期的研究表明水稻根的表皮細(xì)胞是對稱分裂的，根毛發(fā)達(dá)后生毛細(xì)胞比非生毛細(xì)胞的擴(kuò)增速率快，導(dǎo)致根毛成熟時生毛細(xì)胞比非生毛細(xì)胞要小。生毛細(xì)胞比非生毛細(xì)胞的擴(kuò)增速率快可能與生毛細(xì)胞是重要的吸收水分和營養(yǎng)的器官有關(guān)[1]。

Image J是由美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health）開發(fā)的一個基于JAVA的圖像處理軟件，可以顯示、編輯、分析、處理多種圖片格式，由于其操作簡單有效已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域[2-4]。本研究利用Image J軟件首次建立了水稻根毛長度的測量方法，使準(zhǔn)確、簡便地量化水稻根毛的長度成為可能；利用所建立的根毛測量方法對兩組肉眼所見根毛長度無明顯差異的水稻品種進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)此種方法可以揭示出不同水稻品種間根毛長度的差異，從而證明了該測量體系的可行性和有效性，為進(jìn)一步研究水稻根毛發(fā)育及其影響因素打下了量化分析基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻：中旱5號（ZH5）、珍汕97（ZS97），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室提供。

1.2 方法

1）1/2 MS培養(yǎng)基配制。培養(yǎng)基配方為：2.2 g MS粉末、10 g蔗糖、0.5 g MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）、10 g瓊脂，去離子水定容至1 L。調(diào)節(jié)pH至5.8，高溫高壓滅菌15 min后倒入 13 cm×13 cm透明的塑料方形培養(yǎng)皿中，凝固后備用。

2）種子滅菌及幼苗生長。將去掉穎殼的水稻種子分裝在錐形瓶中，加入適量75%（V/V）的乙醇搖晃1 min，棄去乙醇，加入0.15%（m∶V）升汞搖晃15 min，棄去升汞，最后用滅菌水清洗3～5次。將滅過菌的水稻種子橫向（胚背向培養(yǎng)基一側(cè)）擺放在1/2 MS培養(yǎng)基上，每皿10粒。將培養(yǎng)皿封口后豎直向后傾斜15°～20°放置，使根能貼在培養(yǎng)基表面生長。28 ℃光/暗（16 h/8 h）培養(yǎng)或 28 ℃暗培養(yǎng)2 d或3 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根毛的圖像采集

去掉水稻幼苗培養(yǎng)皿封口膜后背面朝上，用體視顯微鏡（Leica S8 APO；CCD：DFC290）拍照，參數(shù)設(shè)置為：1×、曝光440.3、飽和度0.85、伽瑪1.84、增益1.84×。

2.2 水稻根毛的測量

啟動Image J軟件，選擇File→Open（圖1A）打開所拍攝的水稻主根的體視鏡圖片；Analyze→Set Measurements（圖1E）確定標(biāo)尺；選擇Rectangular Selection工具（圖1B），默認(rèn)設(shè)置，將所需測量的部位選定，按鍵盤上的“Ctrl+C”鍵，將所選區(qū)域復(fù)制，F(xiàn)ile→New→Internal Clipboard，所復(fù)制的區(qū)域會作為一個獨立的窗口出現(xiàn)；用Freehand工具，默認(rèn)設(shè)置，將主根選中（圖1C），選擇Analyze→Measure（圖1D）得到主根的面積；選擇Image→Type→8-bit（圖1F）將圖像調(diào)整為灰度模式；選擇Image→Adjust→Threshold（圖1G）通過拖動標(biāo)桿（圖1H）將根毛和主根選中，然后選擇Apply，選擇Analyze→Analyze Particles（圖1I）會彈出一個設(shè)置框，調(diào)整Size（pixel〈2）→1，Show→Outlines→OK，這時會輸出根毛和主根的面積和（圖1J）。根據(jù)公式：根毛的平均長度=（根毛和主根的面積和-主根的面積）/（2×所選區(qū)域的長度），得到根毛的平均長度。

2.3 水稻根毛測量方法的優(yōu)化

以ZH5和ZS97為材料，選取尖端（從距根毛起始處1 mm開始向上4 mm的區(qū)域，圖2A白色箭頭區(qū)域）、基部（從種子端開始向下4 mm的區(qū)域，圖2B）和整體（基部和尖端根毛的平均值）的根毛長度進(jìn)行統(tǒng)計。培養(yǎng)條件和時間也做了相應(yīng)的改變，28 ℃光/暗（16 h/8 h）培養(yǎng)或 28 ℃暗培養(yǎng)2d 或3 d。

2.3.1 培養(yǎng)條件的確定 在光、暗條件下培養(yǎng)2 d，分別對根的尖端、基部和整體的根毛長度進(jìn)行測量。結(jié)果表明，在光、暗條件下ZH5和ZS97兩個品種間各個部位的根毛長度差異都極顯著，但在光培養(yǎng)條件下兩個品種間尖端、基部、整體的P值（分別為4.00E-11、4.06E-08、3.13E-12）遠(yuǎn)小于暗培養(yǎng)下兩個品種間的P值（分別為5.3E-04、2.25E-03、9.2E-04），所以選定光培養(yǎng)為進(jìn)行根毛長度測量的理想條件。

2.3.2 培養(yǎng)時間的確定 分別光培養(yǎng)2 d和3 d，對根的尖端、基部和整體的根毛長度進(jìn)行測量。結(jié)果表明，光下培養(yǎng)2 d和3 d時，ZH5和ZS97兩個品種間各個測量部位的根毛長度差異都極顯著；但在光培養(yǎng)2 d時ZH5種內(nèi)也有顯著性差異（基部的根毛長度和整體的根毛長度相比其P值為0.039），表明光培養(yǎng)2 d時根毛的長度尚未穩(wěn)定，所以選定3 d為測量根毛長度所需的培養(yǎng)時間。

2.3.3 測量部位的確定 光培養(yǎng)3 d，ZH5和ZS97種間根毛長度相比，各部位相比差異都極顯著，尖端（P值為1.194 E-12）的差異比整體（P值為6.783E-09）和基部（P值為3.126E-05）的要更為顯著（圖3，表1）；ZH5和ZS97種內(nèi)根毛長度相比，尖端和基部的根毛長度與整體相比差異都不顯著（表1），所以可以用尖端的根毛長度來衡量水稻根毛的長度。

由上述結(jié)果可以得出，水稻根毛長度測量體系的條件為：水稻光培養(yǎng)3 d，以尖端根毛的長度來衡量整體根的根毛長度。

2.4 水稻根毛測量方法的應(yīng)用

為了驗證上述所建立的根毛測量體系是否切實可行，對圖4中肉眼所見根毛長度無明顯差異的兩個水稻品種根毛長度進(jìn)行了測量，其中A、B、C為同一品種，D、E、F為另一品種。結(jié)果顯示，圖4A～F的水稻根毛長度分別為144.595、172.804、197.843、297.648、351.781、405.156 μm。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，A、B間P值為2.418E-03，B、C間P 值為 2.74E-02，A、C間P值為1.14E-06，D、E間P值為1.25E-02，E、F間P值為4.06E-02，D、F間P值為2.74E-05，這兩組內(nèi)3個樣本間根毛長度的差異都是顯著的，從而證明了所建立的根毛長度測量體系可以用于根毛長度的量化分析，能快速準(zhǔn)確地檢測出各水稻品種間根毛長度的差異。

3 小結(jié)與討論

根毛的長度決定了根和根際接觸的面積大小，進(jìn)而對根吸收水分和營養(yǎng)有重大的影響。關(guān)于根毛初始和伸長的基因已經(jīng)有相關(guān)的報道，在水稻中OsCSLD1、OsAPY、RHL1參與根毛的伸長。根毛的初始和伸長都需要細(xì)胞壁松弛蛋白EXPs。EXP有兩個亞家族EXPA和EXPB，有很多EXPA和EXPB成員已經(jīng)證實在細(xì)胞壁松弛和快速擴(kuò)張中起重要的作用[5-10]。隨著相關(guān)基因的分離，為進(jìn)一步研究水稻根毛發(fā)育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

由于根毛是根成熟區(qū)表皮細(xì)胞的細(xì)長突起，很容易受到損壞。水稻植株較大，根毛密集，所以對水稻根毛長度的測量有一定的難度。試驗采用在培養(yǎng)皿中生長的水稻幼苗作為根毛測量的對象，不僅容易控制而且結(jié)果穩(wěn)定可靠。雖然以前也有研究測量過根毛的長度，但都是取根的特定部分的若干根毛，測量其長度作為根毛的長度[10]，其測量的長度有時不能代表整個根的根毛長度。而該研究采用軟件統(tǒng)計的方法建立了一個新的水稻根毛長度的測量方法，用所選區(qū)域根毛長度的平均值來衡量整體根毛的長度，使得到的數(shù)據(jù)更有說服力。創(chuàng)建的基于Image J軟件的水稻根毛長度測量方法，使對水稻根毛長度的精確量化分析成為可能，將有助于水稻根毛發(fā)育相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及其功能研究，進(jìn)一步推動水稻水分、養(yǎng)分吸收研究的發(fā)展。

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