谷胱甘肽的高效液相色譜及色譜聯(lián)用檢測方法進展*

徐瑩瑩 王燕一

谷胱甘肽的高效液相色譜及色譜聯(lián)用檢測方法進展*

徐瑩瑩 王燕一

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種含有巰基的三肽化合物。機體內(nèi)谷胱甘肽主要以還原型的狀態(tài)存在，氧化應(yīng)激后形成氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)，后者在谷胱甘肽還原酶的作用下再形成還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)。還原型谷胱甘肽具有保護細(xì)胞免遭氧化損傷的重要作用。幾乎所有哺乳動物體內(nèi)都有谷胱甘肽。研究機體內(nèi)還原型谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽的含量，可以評價機體的氧化應(yīng)激情況和疾病發(fā)生的風(fēng)險。雖然很多學(xué)者都對體內(nèi)的氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽進行了檢測，但是檢測結(jié)果差異較大。這是由于GSH發(fā)生自氧化從而造成GSH的低估，及GSSG的高估和(或)GSH／GSSG的低估。本文主要對GSH的色譜以及色譜聯(lián)用例如：液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)等方法進行綜述。

谷胱甘肽；色譜法, 高效液相

谷胱甘肽于1921年由學(xué)者Hopkins FG命名為“Glutathione”[1]。從結(jié)構(gòu)上看，谷胱甘肽是一個由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽化合物。在谷氨酸的側(cè)鏈的羧基組和半胱氨酸的氨基組之間以肽鍵相連[2]。谷胱甘肽有兩個特征結(jié)構(gòu):谷酰基鏈和巰基(-SH)組。這些結(jié)構(gòu)促進其參與多種生理功能。機體內(nèi)谷胱甘肽以兩種形式存在,即GSH和GSSG。GSH－GSSH是真核細(xì)胞中重要的氧化還原緩沖配對。在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起基礎(chǔ)性作用。對GSH－GSSH定性或定量分析都是反應(yīng)機體氧化損傷的重要指標(biāo)。

1.谷胱甘肽概述

1.1谷胱甘肽的臨床意義 GSH是一種重要的抗氧化劑，抗氧化體統(tǒng)功能減弱時，活性氧和活性氮對組織造成不同程度損傷，導(dǎo)致一些慢性疾病發(fā)生，Dalle－Donne等對此作了系統(tǒng)的綜述[3]。谷胱甘肽能夠保護紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài),防止溶血,還可以持續(xù)其正常發(fā)揮運輸氧的能力;能夠與進入機體的有毒化合物(如:丙烯腈、 氟化物、一氧化碳)、重金屬離子等直接結(jié)合,將其轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)并排泄出體外,起到中和解毒的作用。GSH與睡眠相關(guān)[4]。GSH對神經(jīng)元興奮性中毒也有緩解作用;可以用于緩解惡性腫瘤患者化療所致的毒副反應(yīng);治療白內(nèi)障及控制角膜和視網(wǎng)膜等眼部疾病;治療糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病脂肪肝等并發(fā)癥;抑制乙醇侵害肝臟產(chǎn)生脂肪,減輕病毒性肝炎、肝炎肝硬化以及藥物性肝損傷癥狀;谷胱甘肽還具有抗艾滋病病毒的功效。唾液、尿液、全血、血漿、腦體液等體液中谷胱甘肽的含量都具有重要的臨床意義[5]。

1.2谷胱甘肽的代謝反應(yīng) GSH可在谷胱甘肽過氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為GSSG，同時在谷胱甘肽還原酶與還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的共同作用下再生成GSH[6][7]。生理上GSH和NADPH的作用下使得GSSG：GSH的比值為持在1：1000到1:100的范圍內(nèi)[8]。機體氧化應(yīng)激水平增加或者谷胱甘肽還原酶的活性受限(例如6－磷酸葡萄糖脫氫酶的缺乏導(dǎo)致NADPH合成受限)時，導(dǎo)致GSSG、GSSG/GSH增加。大量的GSSG參與細(xì)胞內(nèi)、外的代謝而消耗。細(xì)胞內(nèi)的GSSG轉(zhuǎn)化為GSH[9]。GSH由細(xì)胞內(nèi)移向細(xì)胞外與肝臟和其他組織一起參與各器官之間的代謝反應(yīng)[10]。

GSH與內(nèi)源性集團發(fā)生反應(yīng)，生成具有生物活性的內(nèi)源性谷胱甘肽加合物[9,11]。雖然有些加合物可直接生成，但谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶GST介導(dǎo)的反應(yīng)通常占主導(dǎo)地位。GSH的活性部位是半胱氨酸的巰基。高親和性的巰基使GSH在生理條件發(fā)揮清除自由基的作用[12]。GSH與谷胱甘肽過氧化酶共同作用分解過氧化氫和有機過氧化物[2]。GSH有助于機體其他抗氧化劑的生成，例如維生素E、維生素C等。

GSH通過名為谷胱甘肽化(S-Glutathionylation)的途徑與蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基結(jié)合。谷胱甘肽化可以被逆轉(zhuǎn)，這一反應(yīng)在細(xì)胞信號調(diào)節(jié)機制中也有重要作用[8,13]。谷胱甘肽化在氧化應(yīng)激下有保護不穩(wěn)定巰醇的作用；通過此過程儲存GSH，以防止在氧化應(yīng)激時GSH的減少。已有文獻報道谷胱甘肽化反應(yīng)異?？赡芘c糖尿病、心血管疾病、肺部疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)[14]。

2.GSH和GSSG的測定分析

從20世紀(jì)50年代起,研究者就開始建立谷胱甘肽的各種測定方法,至今仍然有很多改進方法和新穎技術(shù)方案不斷涌現(xiàn)。隨著分析技術(shù)的不斷進步,在檢測技術(shù)的精確度、準(zhǔn)確度、靈敏度和速度等方面都有明顯提高?？v觀谷胱甘肽的測定方法,形式多樣,原理也不盡相同?？梢姺止夤舛确ā⒚阜?、熒光分光光度法、高效液相色譜法等是最主要和常用的方法,其它如差熱掃描(DSC)、紅外檢測等方法雖然不常用,但是在研究工作中也有一定價值。從上世紀(jì)70年代 起,高效液相色譜法法和以上幾種方法結(jié)合進行測定就開始被報道,此后出現(xiàn)了HPLC-UV、HPLC-ECD(high performance liquid chromatography-electrochemical detection)、HPLC－ OPA、HPLC－ GR、HPLC－ MS、LC－MS/MS等一系列方法。這些測定方法主要原理是以HPLC為分離手段，以質(zhì)譜或其它檢測方法為鑒定和測定手段聯(lián)合使用檢測化合物。本文主要對高效液相色譜法(high performance liquid chromatography;HPLC)、LC－MS等相關(guān)方法進行綜述。高效液相色譜法具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測靈敏度高、操作自動化和應(yīng)用范圍廣的特點。對于谷胱甘肽而言還具有可同時檢測出GSH和GSSG的優(yōu)點。

樣品中GSH的準(zhǔn)確測量較為困難,這是由于固體狀態(tài)下的GSH較為穩(wěn)定，液體樣品中的GSH易被氧化為GSSG。GSH與GSSH間存在著氧化還原間的動態(tài)平衡。準(zhǔn)確測量樣品中的GSH和GSSG，避免因GSH被氧化造成的GSSG高估，及GSSG被還原造成的GSSG低估,至關(guān)重要。此外GSH的其它存在形式如GSSX、PROSSG等也會影響到檢測的準(zhǔn)確性。通過研究機體內(nèi)GSH以及GSSG的含量以及他們的關(guān)系對于評價GSH－GSSG氧化還原系統(tǒng)的功能意義重大。因而準(zhǔn)確測量樣品中GSH、GSSG成為目前的研究熱點之一。

2.1色譜柱以及流動相的選擇 未被衍生化的GSH和GSSG是高極性化合物，研究表明GSH可選用極性高的色譜柱進行分離[17]。Dustin Carroll 選用了Luna PFP-2反相色譜柱柱(Phenomenex)，獲得了較好的保留[16]。Isabella Squellerio等[17]學(xué)者選用了兩種方法對GSH進行檢測，一種采用高效液相色譜法和電化學(xué)技術(shù)聯(lián)合(HPLC－ECD)檢測，選用Synergy Hydro-RP(150mm×4.6mm，5m)色譜柱，流動相為含1%乙腈的20mM磷酸鉀緩沖液(正磷酸調(diào)整pH值至2.7)。另一種采用液質(zhì)聯(lián)用(LCMS／MS)技術(shù)，選用Luna PFP(2)(100mm×2.0mm，3m)色譜柱，質(zhì)譜流動相A相為0.75mM的甲酸銨(甲酸調(diào)節(jié)PH值至3.5)，B相為甲醇。兩者比較Isabella Squellerio認(rèn)為GSH的檢測，LC－MS相對于HPLC－ECD具有更高的選擇性,精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度，檢測的穩(wěn)定性也更好。Sophie Robin[18]等 使 用 MODULO CART QS KROMASIL 5C18 (INTERCHIM，F(xiàn)rance)(250mm×2mm×5m)色譜柱，流動相為含0.1%加酸的乙腈／水(50/50, v/v)。 也 有學(xué)者[19]采用Hypercarb的(Thermo Scientific，2.1mm×50mm×5m)色譜柱，流動相A相為含0.1%甲酸的水，B相為0.1%的乙腈，獲得了較準(zhǔn)確的測定結(jié)果。在以往的液相色譜檢測GSH過程中較常用的是反相C18色譜柱，然而認(rèn)為這種色譜柱對極性高的化合物(GSH)保留較低。Yusuke Iwasaki[22]采用了一款更適合檢測高級性化合物的色 譜 柱，HILIC(150mm×2.1mm;Waters, Japan)色譜柱，流動相A相為0.5mM甲酸胺緩沖液(pH 4.0)，B相為乙腈，這款色譜柱更容易分離高極性化合物。

2.2內(nèi)標(biāo)的選擇 由于基質(zhì)效應(yīng)以及其他多方面因素的影響，應(yīng)選用與化合物性質(zhì)較為相似的同位素內(nèi)標(biāo)[19]，如GSH(GSH 13C2,15N)、GSSG(GSSG 13C4,15N2)[20]。但同位素內(nèi)標(biāo)具有價格昂貴、不易獲得等缺點。谷胱甘肽乙酯[21],巰基苯甲酸[15]，谷?；劝彼醄22]，阿昔洛韋等[23]也可作為內(nèi)標(biāo)使用。

2.3樣品預(yù)處理 GSH樣品預(yù)處理過程中最為關(guān)鍵的是防治其發(fā)生氧化。當(dāng)PH＞7時，GSH易發(fā)生非酶促的氧化反應(yīng)，酶促的GSH轉(zhuǎn)化的中介是γ －谷?；D(zhuǎn)肽酶，在中性PH值時其表現(xiàn)出最佳活力。因而建議將PH控制在酸性范圍內(nèi)。Rossi 和Caussé[24-26]已經(jīng)對此進行了論證。此外GSH可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成結(jié)合物glutathionylated protein。在樣品處理中加入含三丁基磷的二甲基甲酰胺10%(V/V)能有效的將其分離[5]。在測量全血、紅細(xì)胞[25]和血漿以及尿液[26]中GSSG時應(yīng)避免由于GSH氧化所造成的GSSG的高估。為了準(zhǔn)確測量GSH以及GSSG，樣品收集、防止氧化、沉蛋白以及對巰基的衍生化反應(yīng)等意義重大。

2.3.1樣品收集 樣品收集過程對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，在全血和血漿中紅細(xì)胞溶血和儲存溫度等因素都對GSH和GSSG化驗的結(jié)果造成潛在影響。樣品收集后應(yīng)盡早冷藏，以減少由于樣品發(fā)生自氧化以及蛋白質(zhì)水解對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾[27]。在抽血過程中防止發(fā)生溶血以及控制儲存溫度對樣品的準(zhǔn)確測量非常重要，血漿收集后建議盡早離心分離[26,27]。溶血的血漿中GSH的易被高估，這是由于紅細(xì)胞中的GSH約為血漿中GSH的500倍。另外，建議采用EDTA抗凝的血液采集管。EDTA不但有抗凝的功能還具有絡(luò)合金屬離子(例如Fe2+)的功能，因而可以防止氧化反應(yīng)的發(fā)生[26,27]。diethylenetriaminopentaacetic acid(DETAPAC)也可作為非常重要的鐵離子螯合劑[28]。

2.3.2.防止 發(fā) 生 氧 化 GSH易 被 氧 化 成GSSH。然而衍生化試劑N-乙基馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide，NEM)[29,30]，碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)的加入使其轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的衍生物將有效的避免這一現(xiàn)象。衍生化試劑的選擇對實驗分析的結(jié)果有很大影響。二硫赤蘚糖醇，二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、等巰基還原劑的使用都給GSH檢測結(jié)果帶來負(fù)面影響，這是由于他們與一些熒光試劑發(fā)生了競爭反應(yīng)。MBB和鄰苯二醛會導(dǎo)致熒光化合物干擾物的形成。

鈉和硼氫化鉀都是高效的還原劑，但是他們在水溶液中不穩(wěn)定[31]。高濃度的還原劑發(fā)生還原反應(yīng)僅需幾分鐘，但是低濃度時(40-100mM)需要30分鐘以上或者加熱的條件下才能完成。反應(yīng)過程中形成的氣體或氣泡可通過加入單磷酸(monophosphoric acid，MPA)或表面活性劑來去除,如辛醇[32]。連二亞硫酸鹽(DT,連二硫酸鈉)也被用于二硫化合物的還原劑。

2.3.3除蛋白 蛋白質(zhì)廣泛存在于生物樣品中，然而它們的存在不但為化合物檢測帶來不同程度干擾，還會堵塞色譜柱、降低儀器的使用壽命等。因此，在多數(shù)情況下蛋白質(zhì)應(yīng)在樣品檢測之前去除。只有少數(shù)方法(例如核磁共振)適用于檢測完整細(xì)胞或應(yīng)用于非脫去蛋白質(zhì)的樣品。酸化、有機溶劑,如乙腈、丙酮或甲醇,超濾等都可用于去除蛋白質(zhì)。常用的酸性除蛋白試劑是5-磺基水楊酸(5-sulfosalicylic acid，5-SSA),三 氯 乙 酸 (trichloroacetic acid，TCA),三 氟 乙 酸(rifluoroacetic acid，TFA),高 氯酸(perchloric acid PCA)等[33,34]。相關(guān)報道提出終濃度為15%的PCA效果最佳[34]。

Caussé等[26]學(xué)者建立了用5-磺基水楊酸(5-SSA)或者乙腈(ACN)沉蛋白結(jié)合以6-iodoacetamidofluorescein (6-IAF)為衍生化試劑檢測GSH的方法。然而在酸性環(huán)境下使用有機溶劑沉蛋白，如未對巰基進行保護將無法避免GSH發(fā)生氧化反應(yīng)。Rossi等[25]學(xué)者發(fā)現(xiàn)將溶液的酸性環(huán)境調(diào)節(jié)至中性或者堿性PH值后，如果沒有預(yù)先對巰基進行保護也會使巰基的濃度迅速降低。因而沉蛋白前保持巰基的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

此外，應(yīng)用過濾的方法限制大分子的物質(zhì)的濾過，也是一種有效去除蛋白質(zhì)的方法[35-36]。這種方法的優(yōu)點是不需要加入影響分離、衍生化、檢測的酸和有機溶劑。大多數(shù)蛋白還可以應(yīng)用膜濾法結(jié)合微濃度離心的方法去除[37]。Yusuke Iwasaki等[22]通過固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)的方法去除唾液中的蛋白獲得較好的效果。

2.3.4 GSH的衍生化 GSH有三個衍生化的位點,分別是羧基、氨基和硫醇,但首選發(fā)生衍生化的位點是硫醇。相比之下,GSSG能進行衍生化的位點只有兩個，分別是氨基和羧基組。

最常用的衍生化反應(yīng)化合物是NEM[30,38],IAA[39]和碘乙酰胺(IA)[40]。5，5’二硫硝基苯甲酸(5,5 ′ -dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)也是一種檢測GSH和GSSG的衍生化試劑[21,41,42]。NEM可與與巰醇發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，常被用于熒光檢測與質(zhì)譜聯(lián)用來測定GSSG[15,43-45]。但IA發(fā)生衍生化反應(yīng)的同時，也產(chǎn)生了一些干擾物質(zhì)。由于NEM對谷胱甘肽還原酶(GR)的抑制作用，應(yīng)用NEM與谷胱甘肽還原酶的偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生較為困難。同時需注意的是當(dāng)PH大于7.5時NEM會與氨基發(fā)生反應(yīng)，雖然相比較巰基來說此反應(yīng)發(fā)生的較少[24]。因此當(dāng)反應(yīng)在堿性條件下，或者使用了氨基的衍生化試劑例如FDNB時，反應(yīng)后多余的NEM應(yīng)在變成堿性化媒介之前去除。已有學(xué)者證實只有在酸化前加入NEM才可以防止巰基組氧化，否則會造成GSH的低估，以及GSSG的高估。但Tereza Moore[19]建立了同時加入NEM和SSA的一步反應(yīng)，也獲得了較好的結(jié)果。

3.結(jié)語

GSH作為細(xì)胞的一種抗氧化劑,參與多種重要的生理過程,可保護細(xì)胞免遭氧化損傷,解除藥物代謝產(chǎn)物的毒性,調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡,并與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。GSH參加抗氧化酶的酶促反應(yīng),具有協(xié)調(diào)內(nèi)源性與外源性抗氧化劑的作用。同時GSH維持自由基的產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡,并使內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定的還原態(tài)。GSH對維持機體健康以及疾病發(fā)生有預(yù)防和治療的作用。在GSH測定過程中，最為重要的是維持樣品中GSH的穩(wěn)定，防止氧化。目前，對于維持其穩(wěn)定并且準(zhǔn)確測定已有較為全面的研究，但存在操作繁瑣、重復(fù)性差、以及樣品處理方法說法不一等問題。準(zhǔn)確對機體GSH進行定量及定性分析，并對其狀態(tài)做出正確評價具有重要臨床意義，其方法學(xué)還需繼續(xù)改進。

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Application of HPLC and hyphenated chromatograph on Glutathione measurement

XU Ying-ying, WANG Yan-yi.
(Department of Stomatology, the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Glutathione (GSH) is a thiol-containing tripeptide. Free glutathione is present mainly in its reduced form, which can be converted to the oxidized glutathione (GSSG) during oxidative stress, and can be reverted to the reduced form by the action of the enzyme glutathione reductase(GSH).Reduced glutathione plays an essential role in protecting cells from oxidative damage . Almost all mammals have glutathione in their bodies Measurement of GSH and GSSG is a useful indicator of oxidative stress and disease risk. As a possible marker of oxidative stress, many studies have measured GSH and GSSG. However, large differences in GSH and GSSG levels reported in different studies, calls for a reliable standardized method. This is due to the autoxidation of GSH resulting in an underestimation of GSH, and the overestimation of GSSG and (or) GSH / GSSG underestimation In this paper, we review determination GSH and GSSG with high performance liquid chromatography (HPLC)and hyphenated chromatography such as liquid chromatographmass spectrometer(LC-MS),et al.

Glutathione ; Chromatography, High Performance Liquid

R781

A< class="emphasis_bold">[文章編號]1

1672-2973(2017)01-0051-06

2016-08-10)

“十二五”國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(項目編號:2012AA020809)三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項目(項目編號:2014YW34)

徐瑩瑩 解放軍總醫(yī)院口腔科 碩士生 北京 100853

王燕一 通訊作者 解放軍總醫(yī)院海南分院口腔科 主任醫(yī)師 副教授 海南 572013